| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-12页 |
| 表目录 | 第12-14页 |
| 图目录 | 第14-16页 |
| 英文缩略表 | 第16-17页 |
| 第一章 引言 | 第17-35页 |
| ·研究目的和意义 | 第17页 |
| ·国内外研究现状 | 第17-33页 |
| ·microRNA 的概述 | 第17-21页 |
| ·与奶牛乳腺发育和泌乳相关的 microRNA 的研究进展 | 第21-25页 |
| ·bta-miR-145 的研究进展 | 第25-27页 |
| ·bta-miR-145 的生物信息学分析 | 第27-33页 |
| ·研究内容和技术路线 | 第33-35页 |
| ·研究内容 | 第33-34页 |
| ·技术路线 | 第34-35页 |
| 第二章 牛 IRS1 基因的 3′RACE 测序及结合位点分析 | 第35-46页 |
| ·材料与方法 | 第35-40页 |
| ·牛乳腺组织 Total RNA 提取 | 第35页 |
| ·已知序列验证 | 第35-36页 |
| ·3 ′端序列获取 | 第36-38页 |
| ·RACE 序列验证 | 第38页 |
| ·序列拼接 | 第38-39页 |
| ·对测得的 IRS13’RACE 序列进行生物信息学分析 | 第39-40页 |
| ·结果与分析 | 第40-45页 |
| ·牛乳腺组织 Total RNA 提取结果 | 第40页 |
| ·已知序列验证结果 | 第40-41页 |
| ·3 ′端序列获取结果 | 第41-42页 |
| ·RACE 序列验证结果 | 第42-43页 |
| ·用 Sequencher 4.9 软件对上述测得的序列进行拼接的结果 | 第43-44页 |
| ·对测得的 IRS13’RACE 序列进行生物信息学分析结果 | 第44-45页 |
| ·讨论 | 第45页 |
| ·结论 | 第45-46页 |
| 第三章 奶牛乳腺上皮细胞系的建立及β-酪蛋白的诱导表达 | 第46-55页 |
| ·材料与方法 | 第46-49页 |
| ·主要设备、试剂、耗材 | 第46页 |
| ·培养液 | 第46-47页 |
| ·奶牛乳腺上皮细胞原代培养 | 第47页 |
| ·奶牛乳腺上皮细胞的纯化 | 第47页 |
| ·奶牛乳腺上皮细胞的角蛋白-18 鉴定 | 第47-48页 |
| ·奶牛乳腺上皮细胞的冻存与复苏 | 第48页 |
| ·奶牛乳腺上皮细胞生长曲线的绘制 | 第48页 |
| ·奶牛乳腺上皮细胞中β-酪蛋白的诱导表达 | 第48-49页 |
| ·结果与分析 | 第49-53页 |
| ·奶牛乳腺上皮细胞原代培养 | 第49-50页 |
| ·奶牛乳腺上皮细胞的纯化 | 第50-51页 |
| ·奶牛乳腺上皮细胞生长曲线 | 第51页 |
| ·免疫细胞荧光染色法鉴定乳腺上皮细胞角蛋白-18 的表达 | 第51-52页 |
| ·奶牛乳腺上皮细胞中β-酪蛋白的诱导表达结果 | 第52-53页 |
| ·讨论 | 第53-54页 |
| ·结论 | 第54-55页 |
| 第四章 bta-miR-145 mimic、inhibitor 转染条件的摸索及对细胞活力的影响 | 第55-68页 |
| ·材料与方法 | 第55-61页 |
| ·转染前细胞接种密度的摸索 | 第55页 |
| ·转染时 RNAi 与脂质体 2000 的最适添加量 | 第55-56页 |
| ·qPCR 检测转染后 miR-145 过表达和抑制表达的效果 | 第56-60页 |
| ·转染后的细胞活力检测 | 第60页 |
| ·miR-145 过表达和抑制表达后对的其它几种 microRNA 基因表达的影响 | 第60-61页 |
| ·结果与分析 | 第61-65页 |
| ·转染前细胞接种密度的摸索结果 | 第61-62页 |
| ·转染时 RNAi 与脂质体 2000 的最适添加量及转染效率 | 第62-63页 |
| ·qPCR 检测牛乳腺上皮细胞中 miR-145 过表达和抑制表达的效果 | 第63-64页 |
| ·转染后的细胞活力检测结果 | 第64页 |
| ·miR-145 过表达和抑制表达对其它几种 microRNA 的影响 | 第64-65页 |
| ·讨论 | 第65-66页 |
| ·结论 | 第66-68页 |
| 第五章 bta-miR-145 靶向 IRS1、CSN2 的 RT-qPCR 验证及 Western Blot 验证 | 第68-78页 |
| ·材料与方法 | 第68-71页 |
| ·细胞处理和瞬时转染 | 第68页 |
| ·样品 RNA 提取、反转录及荧光定量反应 | 第68-69页 |
| ·Western Blot 试验的主要设备、试剂、耗材 | 第69页 |
| ·细胞蛋白样品的制备 | 第69-70页 |
| ·SDS-PAGE 电泳 | 第70-71页 |
| ·转膜 | 第71页 |
| ·封闭、抗体孵育和显色 | 第71页 |
| ·结果与分析 | 第71-76页 |
| ·过表达对预测靶基因 CSN2 和 IRS1 mRNA 表达的影响 | 第71-72页 |
| ·抑制表达对预测靶基因 CSN2 和 IRS1 mRNA 表达的影响 | 第72-73页 |
| ·BCA 法测定蛋白浓度标准曲线绘制 | 第73页 |
| ·SDS-PAGE 胶考马斯亮兰的染色结果 | 第73-74页 |
| ·丽春红染膜的结果 | 第74页 |
| ·转染后牛乳腺上皮细胞中 IRS1 和 CSN2 蛋白表达的变化 | 第74-76页 |
| ·讨论 | 第76-77页 |
| ·结论 | 第77-78页 |
| 第六章 bta-miR-145 靶向 IRS1、CSN2 的双荧光报告基因检测 | 第78-91页 |
| ·材料与方法 | 第78-83页 |
| ·主要设备、试剂、耗材 | 第78页 |
| ·牛乳腺组织 RNA 的提取和反转录 | 第78页 |
| ·牛重组载体 CSN2-WT 和 IRS1-WT 的构建 | 第78-83页 |
| ·双荧光素酶报告载体分析 miRNA 作用靶点 | 第83页 |
| ·结果与分析 | 第83-89页 |
| ·基因 3’UTR PCR 扩增结果 | 第83-84页 |
| ·重组载体菌液 PCR、双酶切和测序结果 | 第84-88页 |
| ·双荧光素酶表达分析结果 | 第88-89页 |
| ·讨论 | 第89-90页 |
| ·结论 | 第90-91页 |
| 第七章 全文结论 | 第91-93页 |
| ·结论 | 第91-92页 |
| ·本试验创新点 | 第92页 |
| ·有待于进一步研究的问题 | 第92-93页 |
| 参考文献 | 第93-102页 |
| 致谢 | 第102-103页 |
| 作者简介 | 第103-104页 |
