| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-13页 |
| 1 文献综述 | 第13-25页 |
| ·基因敲除技术的发展 | 第13-19页 |
| ·基因敲除的理论基础 | 第13-14页 |
| ·杂合性缺失 | 第14页 |
| ·体细胞打靶 | 第14-15页 |
| ·新型基因打靶技术 | 第15-17页 |
| ·细胞筛选策略 | 第17-19页 |
| ·GGAT1基因敲除猪的研究 | 第19-21页 |
| ·GGAT1基因与HAR | 第19-20页 |
| ·国外GGAT1基因敲除猪的研究进展 | 第20-21页 |
| ·国内GGAT1基因敲除猪的研究进展 | 第21页 |
| ·异种器官移植研究的进展 | 第21-25页 |
| ·异种器官移植的发展 | 第22-23页 |
| ·异种器官移植存在的问题 | 第23-24页 |
| ·异种器官移植的优势 | 第24页 |
| ·猪在异种器官移植中的作用 | 第24-25页 |
| 2 本研究的目的意义 | 第25-26页 |
| 3 材料和方法 | 第26-41页 |
| ·试验材料 | 第26-31页 |
| ·动物性材料 | 第26页 |
| ·实验仪器 | 第26-27页 |
| ·试验耗材 | 第27-28页 |
| ·药品及试剂配制 | 第28-31页 |
| ·实验方法 | 第31-41页 |
| ·成纤维细胞系的建立和成纤维细胞培养 | 第31-32页 |
| ·耳成纤维细胞的传代培养 | 第32页 |
| ·耳成纤维细胞的冻存 | 第32页 |
| ·耳成纤维细胞的解冻 | 第32-33页 |
| ·LOH突变细胞的扩繁 | 第33页 |
| ·TALEN打靶载体的成纤维细胞转染 | 第33页 |
| ·GGTA1~(-/-)细胞的富集或分选 | 第33-34页 |
| ·单细胞克隆的培养 | 第34页 |
| ·单细胞克隆的鉴定 | 第34-36页 |
| ·体细胞核移植的供体细胞准备 | 第36-37页 |
| ·卵母细胞体外成熟 | 第37页 |
| ·体细胞核移植 | 第37页 |
| ·重构卵的融合与激活 | 第37-38页 |
| ·重构胚的培养与胚胎移植 | 第38页 |
| ·克隆猪PCR鉴定 | 第38页 |
| ·克隆猪基因组Southern杂交鉴定 | 第38-40页 |
| ·GGTA~(-/-)克隆仔猪的功能验证 | 第40页 |
| ·细胞裂解分析方法 | 第40-41页 |
| 4 结果与分析 | 第41-51页 |
| ·GGTA1~(-/-)细胞的分选与富集结果 | 第41页 |
| ·LOH突变细胞扩繁与富集结果 | 第41页 |
| ·TALEN转染细胞富集结果 | 第41页 |
| ·单细胞克隆培养与鉴定结果 | 第41-45页 |
| ·单细胞克隆培养结果 | 第41-42页 |
| ·LOH突变的单细胞克隆中GGTA1~(-/-)细胞鉴定结果 | 第42-43页 |
| ·TALEN转染的单细胞克隆中GGTA1~(-/-)细胞鉴定结果 | 第43-45页 |
| ·重构胚体外发育结果 | 第45-46页 |
| ·胚胎移植结果 | 第46-47页 |
| ·GGTA1~(-/-)五指山小型猪的鉴定结果 | 第47-48页 |
| ·仔猪PCR鉴定结果 | 第47页 |
| ·Southern Blotting鉴定结果 | 第47-48页 |
| ·测序鉴定结果 | 第48页 |
| ·GGTA1~(-/-)克隆猪的功能验证结果 | 第48-51页 |
| ·双敲(GGTA1~(-/-))五指山小型猪细胞系建立结果 | 第48-49页 |
| ·细胞表面α1,3Ga1表位检测结果 | 第49-50页 |
| ·细胞裂解试验分析 | 第50-51页 |
| 5 讨论 | 第51-54页 |
| ·GGAT1~(-/-)细胞筛选方法的选择 | 第51-52页 |
| ·第二次打靶与LOH突变的利用 | 第52-53页 |
| ·新型基因打靶技术—TALEN的选用 | 第53页 |
| ·影响克隆效率的因素 | 第53-54页 |
| ·影响细胞死亡率的因素 | 第54页 |
| 6 结论 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-60页 |
| 致谢 | 第60-61页 |
| 攻读学位期间发表论文 | 第61页 |
