| 摘要 | 第1-11页 |
| Abstract | 第11-13页 |
| 第一章 前言 | 第13-21页 |
| 1.本研究的意义 | 第13-14页 |
| 2.ISSR分子标记的研究进展 | 第14页 |
| 3.蔷薇科植物花芽休眠解除的需冷量研究进展 | 第14-19页 |
| ·需冷量概念 | 第14页 |
| ·需冷量的计算方式 | 第14-15页 |
| ·冷温单位（chillingunit,C.U） | 第14页 |
| ·≤7.2℃模式和0～7.2℃模式 | 第14-15页 |
| ·动力学模型（dynamicmodel） | 第15页 |
| ·蔷薇科植物花芽休眠解除的研究进展 | 第15-19页 |
| ·蔷薇科植物花芽休眠解除与低温的研究进展 | 第15页 |
| ·蔷薇科不同植物花芽休眠解除低温需求的研究进展 | 第15-17页 |
| ·桃树花芽休眠解除的低温需求 | 第15-16页 |
| ·苹果树花芽休眠解除的低温需求 | 第16页 |
| ·梨树花芽休眠解除的低温需求 | 第16-17页 |
| ·杏树花芽休眠解除的低温需求 | 第17页 |
| ·蔷薇科植物花芽休眠解除的其它可能机制 | 第17-19页 |
| ·休眠解除与激素的关系 | 第17-18页 |
| ·休眠解除的相关分子机理 | 第18-19页 |
| 4.本研究的技术路线 | 第19-21页 |
| ·38份梨花品种基于ISSR聚类结果的低需冷量特性分析 | 第19-20页 |
| ·梨花芽休眠差减文库的构建及相关基因的分离 | 第20-21页 |
| ·正向文库 | 第20页 |
| ·反向文库 | 第20-21页 |
| 第二章 38份梨花品种基于ISSR聚类结果的需冷量特性分析 | 第21-37页 |
| 1 实验材料 | 第21-23页 |
| ·供试材料 | 第21-22页 |
| ·实验主要仪器、试剂 | 第22-23页 |
| ·主要仪器 | 第22页 |
| ·主要试剂 | 第22-23页 |
| ·分析处理软件 | 第23页 |
| 2 实验方法 | 第23-26页 |
| ·实验所需药品配制方法 | 第23页 |
| ·供试材料DNA的提取方法 | 第23-24页 |
| ·DNA质量的检测方法 | 第24页 |
| ·ISSR体系的优化方法 | 第24-25页 |
| ·引物筛选及PCR扩增 | 第25页 |
| ·ISSR-PCR聚类结果分析方法 | 第25-26页 |
| 3 结果与分析 | 第26-35页 |
| ·DNA模板的提取结果与分析 | 第26页 |
| ·ISSR-PCR体系优化的结果与分析 | 第26-32页 |
| ·适宜模板DNA用量的确定 | 第26-27页 |
| ·引物浓度的确定 | 第27页 |
| ·dNTP浓度的确定 | 第27-28页 |
| ·TaqDNA聚合酶用量的确定 | 第28-29页 |
| ·Mg~(2+)浓度的确定 | 第29-30页 |
| ·退火温度的确定 | 第30页 |
| ·反应循环数的确定 | 第30-31页 |
| ·最佳反应体系和退火温度的验证 | 第31-32页 |
| ·引物筛选结果 | 第32-33页 |
| ·ISSR多态性分析 | 第33页 |
| ·遗传相似性系数分析 | 第33-34页 |
| ·ISSR聚类结果与低需冷量关系的分析 | 第34-35页 |
| 4 讨论 | 第35-37页 |
| ·梨基因组DNA提取的讨论 | 第35页 |
| ·影响ISSR-PCR反应的因素分析 | 第35-37页 |
| ·模板DNA的用量的讨论 | 第36页 |
| ·Mg~(2+)浓度的讨论 | 第36页 |
| ·TaqDNA聚合酶用量的讨论 | 第36页 |
| ·dNTP和引物浓度的讨论 | 第36页 |
| ·PCR反应循环数的讨论 | 第36-37页 |
| ·退火温度范围的讨论 | 第37页 |
| ·ISSR聚类结果与低需冷量之间的讨论 | 第37页 |
| 第三章 梨花芽休眠解除差减文库的构建 | 第37-60页 |
| 1 材料 | 第37-39页 |
| ·实验样品 | 第37页 |
| ·石蜡切片相关材料和试剂 | 第37-38页 |
| ·实验器具 | 第37-38页 |
| ·实验药品及其配制 | 第38页 |
| ·差减文库相关材料和试剂 | 第38-39页 |
| ·实验试剂 | 第38页 |
| ·实验所需药品的配制 | 第38-39页 |
| ·实验所用器材 | 第39页 |
| 2 实验方法 | 第39-45页 |
| ·实验样品处理方法 | 第39页 |
| ·实验样品的采集方法 | 第39页 |
| ·实验样品的处理方法 | 第39页 |
| ·石蜡切片制作方法 | 第39-40页 |
| ·材料的固定 | 第39页 |
| ·脱水 | 第39-40页 |
| ·透明 | 第40页 |
| ·浸蜡与包埋 | 第40页 |
| ·切片 | 第40页 |
| ·贴片与干片 | 第40页 |
| ·材料的脱蜡，染色，脱水，透明及封片 | 第40页 |
| ·镜鉴观察拍照 | 第40页 |
| ·单链差减文库（DSN-mediatedsinglestrandscDNAsubtraction）的构建方法 | 第40-45页 |
| ·RNA的提取方法（CTAB-Trizol法）28 | 第40-41页 |
| ·Tester的制备（正向记为ZT,反向记为FT）29 | 第41页 |
| ·Driver（正向记为ZD，反向记为FD）的制备（正、反向各两管） | 第41-42页 |
| ·Tester与Driver的杂交 | 第42页 |
| ·杂交产物的DSN处理 | 第42页 |
| ·第一轮LA-PCR扩增 | 第42-43页 |
| ·第二轮LA-PCR扩增 | 第43页 |
| ·第三轮LA-PCR扩增 | 第43页 |
| ·蛋白酶K处理和纯化 | 第43-44页 |
| ·扩增产物的sfiⅠ酶切及切胶半透膜回收 | 第44页 |
| ·酶切产物与定向克隆的连接 | 第44页 |
| ·连接产物的电转化 | 第44页 |
| ·插入片段大小的检测 | 第44页 |
| ·DSN-mediatedsinglestrandscDNAsubtraction的测序及EST分析 | 第44页 |
| ·QRT-PCR检测文库质量 | 第44-45页 |
| ·材料 | 第44页 |
| ·主要试剂与仪器 | 第44页 |
| ·引物设计 | 第44-45页 |
| ·RNA的提取 | 第45页 |
| ·cDNA第一链的合成及实时PCR操作方法 | 第45页 |
| ·相对表达量计算方法 | 第45页 |
| 3 结果与分析 | 第45-57页 |
| ·样品处理过程结果分析 | 第45页 |
| ·石蜡切片结果分析 | 第45-46页 |
| ·差减文库结果分析 | 第46-57页 |
| ·总RNA质量的检测 | 第46-47页 |
| ·Tester和Driver的检测 | 第47-48页 |
| ·DSN梯度筛选 | 第48页 |
| ·第一轮LA-PCR扩增 | 第48页 |
| ·第二轮LA-PCR扩增 | 第48-49页 |
| ·第三轮LA-PCR扩增 | 第49-50页 |
| ·PCR产物的酶切透析回收 | 第50页 |
| ·酶切产物的克隆及插入片段的PCR检测 | 第50-51页 |
| ·花芽休眠解除正、反向差减文库（PZ,PF）相关EST测序及分析 | 第51-55页 |
| ·生物信息学分析 | 第55-56页 |
| ·文库质量检测结果及分析 | 第56-57页 |
| 4 讨论 | 第57-60页 |
| ·石蜡切片 | 第57-58页 |
| ·差减文库的构建 | 第58-60页 |
| ·梨花芽总RNA的提取 | 第58页 |
| ·Tester与Driver的制备 | 第58页 |
| ·DSN技术与LA-PCR结合保证差异基因的筛选和富集 | 第58页 |
| ·梨花芽休眠解除相关基因分析 | 第58-60页 |
| 参考文献 | 第60-64页 |
| 附录 | 第64-83页 |
| 附录1：哥伦比亚大学(UBC)公布的100条ISSR引物序列及其最适解链温度 | 第64-66页 |
| 附录2：不同引物的扩增结果 | 第66-76页 |
| 附录3：不同时期黄花梨花芽采样情况 | 第76页 |
| 附录4：花芽采集与处理过程 | 第76-77页 |
| 附录5：正、反向差减文库EST序列结果与Phytozome植物基因组学数据库的苹果基因组进行比对 | 第77-83页 |
| 致谢 | 第83-84页 |
