| 主要创新点 | 第1-10页 |
| 略语表 | 第10-11页 |
| 中文摘要 | 第11-14页 |
| 英文摘要 | 第14-17页 |
| 第一章 综述 | 第17-45页 |
| §1.1 引言 | 第17页 |
| §1.2 EF-手结构蛋白的性质 | 第17-22页 |
| ·EF-手结构蛋白的概况和分类 | 第17-18页 |
| ·EF-手结构蛋白的钙配位性质 | 第18-20页 |
| ·成对的EF-手结构是蛋白功能单位 | 第20页 |
| ·调节功能和结构功能 | 第20-22页 |
| §1.3 中心蛋白的结构 | 第22-24页 |
| ·中心蛋白的序列分析 | 第22-24页 |
| ·中心蛋白的高级结构 | 第24页 |
| §1.4 中心蛋白的作用机制 | 第24-26页 |
| §1.5 中心蛋白的功能 | 第26-33页 |
| ·绿藻中心蛋白 | 第26-27页 |
| ·酵母中心蛋白 | 第27-29页 |
| ·哺乳动物细胞中心蛋白 | 第29-31页 |
| ·高等植物中心蛋白 | 第31-32页 |
| ·原生生物中心蛋白 | 第32-33页 |
| §1.6 本课题研究意义和设计思路 | 第33-34页 |
| ·研究意义 | 第33页 |
| ·设计思路 | 第33-34页 |
| 参考文献 | 第34-45页 |
| 第二章 中心蛋白突变体和截短型重组质粒的构建 | 第45-58页 |
| §2.1 引言 | 第45页 |
| §2.2 材料 | 第45-47页 |
| ·菌种与质粒 | 第45页 |
| ·寡核苷酸 | 第45-46页 |
| ·主要酶及生化试剂 | 第46页 |
| ·主要试剂 | 第46-47页 |
| ·主要仪器设备 | 第47页 |
| §2.3 方法 | 第47-52页 |
| ·重组质粒(pGEM-T-easy-centrin)的提取和鉴定 | 第47-48页 |
| ·突变的重组质粒(pGEM-T-easy-M-centrin)构建 | 第48-52页 |
| ·片段分子的基因片段 | 第52页 |
| §2.4 实验结果 | 第52-54页 |
| ·重组质粒(pGEM-T-easy-centrin)的提取和鉴定 | 第52页 |
| ·突变的PCR产物扩增结果、酶切和PCR鉴定 | 第52-53页 |
| ·片段分子的PCR产物扩增结果 | 第53-54页 |
| ·突变的重组质粒pGEM-T-easy-M-Centrin序列测定 | 第54页 |
| §2.5 讨论 | 第54-55页 |
| ·突变的重组质粒(pGEM-T-easy-M-centrin)基因的构建 | 第54页 |
| ·PCR实验 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-58页 |
| 第三章 中心蛋白突变体和截短型的表达、纯化 | 第58-71页 |
| §3.1 引言 | 第58页 |
| §3.2 材料 | 第58-60页 |
| ·菌种与质粒 | 第58页 |
| ·主要酶及生化试剂 | 第58-59页 |
| ·主要试剂 | 第59-60页 |
| ·主要仪器设备 | 第60页 |
| §3.3 方法 | 第60-64页 |
| ·重组表达质粒pGEX-6p-1-M-centrin(或者片段基因)的构建 | 第60-62页 |
| ·融合蛋白的表达鉴定 | 第62页 |
| ·目标蛋白的分离纯化 | 第62-64页 |
| §3.4 实验结果 | 第64-68页 |
| ·突变的重组质粒pGEX-6P-1-M-Centrin酶切和PCR鉴定 | 第64-65页 |
| ·截短型重组载体的酶切鉴定 | 第65页 |
| ·重组菌的小量试表达 | 第65-66页 |
| ·蛋白的纯化 | 第66-67页 |
| ·截短型P23、P123的表达和纯化 | 第67-68页 |
| §3.5 讨论 | 第68-69页 |
| ·突变蛋白和截短蛋白一级结构分析 | 第68页 |
| ·重组蛋白的表达和纯化 | 第68-69页 |
| 参考文献 | 第69-71页 |
| 第四章 中心蛋白的金属离子结合性质 | 第71-87页 |
| §4.1 引言 | 第71页 |
| §4.2 材料 | 第71-72页 |
| ·主要试剂 | 第71-72页 |
| ·仪器 | 第72页 |
| §4.3 方法 | 第72-73页 |
| ·稀土离子(Tb~(3+))储备液的配制 | 第72页 |
| ·不同缓冲液的样品的制备 | 第72页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第72页 |
| ·紫外光谱的测定 | 第72页 |
| ·荧光光谱的测定 | 第72-73页 |
| ·圆二色谱的测定 | 第73页 |
| §4.4 实验结果 | 第73-83页 |
| ·中心蛋白野生型(Cen)和G115W的紫外光谱 | 第73页 |
| ·脱钙中心蛋白野生型(Cen)和G115W与钙结合的紫外差光谱 | 第73-74页 |
| ·脱钙中心蛋白野生型(Cen)和G115W与钙和铽结合的CD谱 | 第74-75页 |
| ·不同离子和Cen结合的构象变化 | 第75-76页 |
| ·Cen结合Ca~(2+)和Tb~(3+)后的聚合现象 | 第76-77页 |
| ·中心蛋白野生型(Cen)和G115W的荧光光谱 | 第77-79页 |
| ·Cen和G115W对铽离子的敏化荧光光谱 | 第79-81页 |
| ·P123和P23对铽离子的敏化荧光光谱 | 第81-82页 |
| ·D37K、D73K和D146K对铽离子的敏化荧光光谱 | 第82-83页 |
| §4.5 讨论 | 第83-85页 |
| ·金属结合位点的亲和性 | 第83-84页 |
| ·loop区第一个氨基酸D的重要性 | 第84页 |
| ·EF-hand结构的协同性 | 第84-85页 |
| 参考文献 | 第85-87页 |
| 第五章 中心蛋白的聚合性质 | 第87-99页 |
| §5.1 引言 | 第87页 |
| §5.2 材料 | 第87-88页 |
| ·主要试剂 | 第87页 |
| ·Nature-PAGE相关试剂 | 第87-88页 |
| ·仪器 | 第88页 |
| §5.3 方法 | 第88页 |
| ·稀土离子(Tb~(3+))储备液的配制 | 第88页 |
| ·TNS溶液的配制 | 第88页 |
| ·样品的制备 | 第88页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第88页 |
| ·荧光光谱的测定 | 第88页 |
| ·Nature-PAGE凝胶电泳 | 第88页 |
| §5.4 实验结果 | 第88-96页 |
| ·共振光散射 | 第88-89页 |
| ·中心蛋白的聚合行为 | 第89-90页 |
| ·蛋白浓度对聚合的影响 | 第90页 |
| ·温度对聚合的影响 | 第90-91页 |
| ·pH对聚合的影响 | 第91页 |
| ·离子强度对聚合的影响 | 第91-92页 |
| ·TNS对聚合的影响 | 第92-93页 |
| ·片段分子P23、P123的聚合现象 | 第93-94页 |
| ·突变体D37K、D73K和D146K的聚合行为 | 第94-95页 |
| ·Nature-PAGE电泳检测中心蛋白聚合行为 | 第95-96页 |
| §5.5 讨论 | 第96-97页 |
| ·聚合的性质 | 第96页 |
| ·聚合的本质 | 第96-97页 |
| 参考文献 | 第97-99页 |
| 第六章 TNS检测中心蛋白结合金属后的构象变化 | 第99-112页 |
| §6.1 引言 | 第99页 |
| §6.2 材料 | 第99页 |
| ·主要试剂 | 第99页 |
| ·主要仪器 | 第99页 |
| §6.3 方法 | 第99-100页 |
| ·储备液的配制 | 第99-100页 |
| ·蛋白样品的制备 | 第100页 |
| ·光谱的测定 | 第100页 |
| §6.4 实验结果 | 第100-108页 |
| ·中心蛋白和TNS作用的荧光光谱 | 第100页 |
| ·中心蛋白和TNS结合 | 第100-104页 |
| ·TNS和突变体G115W的色氨酸残基间的能量转移 | 第104-106页 |
| ·Cen-TNS与Tb~(3+)结合的荧光光谱 | 第106-107页 |
| ·D37K-TNS、D73K-TNS与Tb~(3+)的结合 | 第107页 |
| ·P123-TNS、P23-TNS与Tb~(3+)的结合 | 第107-108页 |
| ·不同离子对P23构象变化的比较 | 第108页 |
| §6.5 讨论 | 第108-110页 |
| ·中心蛋白结合金属离子后发生构象变化 | 第108-109页 |
| ·不同金属对构象变化的影响 | 第109-110页 |
| 参考文献 | 第110-112页 |
| 第七章 中心蛋白和蜂毒素的作用 | 第112-121页 |
| §7.1 引言 | 第112页 |
| §7.2 材料 | 第112页 |
| ·主要试剂 | 第112页 |
| ·仪器 | 第112页 |
| §7.3 方法 | 第112-113页 |
| ·储备液的配制 | 第112页 |
| ·蛋白样品的制备 | 第112页 |
| ·蜂毒素储备液的配制 | 第112-113页 |
| ·荧光光谱 | 第113页 |
| §7.4 实验结果 | 第113-117页 |
| ·中心蛋白和蜂毒素的结合 | 第113-114页 |
| ·金属离子对中心蛋白和蜂毒素结合的影响 | 第114-115页 |
| ·pH对中心蛋白和蜂毒素结合的影响 | 第115页 |
| ·TNS对中心蛋白和蜂毒素结合的影响 | 第115-116页 |
| ·片段分子P23、P123与蜂毒素的作用 | 第116-117页 |
| ·G115W与蜂毒素的作用 | 第117页 |
| §7.5 讨论 | 第117-119页 |
| ·中心蛋白和蜂毒素的结合 | 第117-118页 |
| ·中心蛋白和蜂毒素的作用模式 | 第118-119页 |
| ·中心蛋白和蜂毒素的作用力 | 第119页 |
| 参考文献 | 第119-121页 |
| 第八章 中心蛋白和三氟啦嗪的作用 | 第121-128页 |
| §8.1 引言 | 第121页 |
| §8.2 材料 | 第121-122页 |
| ·主要试剂 | 第121-122页 |
| ·仪器 | 第122页 |
| §8.3 方法 | 第122页 |
| ·储备液的配制 | 第122页 |
| ·蛋白样品的制备 | 第122页 |
| ·TFP储备液的配制 | 第122页 |
| ·荧光光谱 | 第122页 |
| §8.4 实验结果 | 第122-126页 |
| ·TFP的光谱性质 | 第122-123页 |
| ·TFP和中心蛋白作用的荧光光谱 | 第123-124页 |
| ·TFP和P23、P123的作用的荧光光谱研究 | 第124-125页 |
| ·TFP对中心蛋白聚合性质的影响 | 第125-126页 |
| ·TFP对中心蛋白与蜂毒素结合的影响 | 第126页 |
| §8.5 讨论 | 第126-127页 |
| ·TFP和中心蛋白的结合位点 | 第126-127页 |
| ·TFP对中心蛋白的生物功能的阻断 | 第127页 |
| 参考文献 | 第127-128页 |
| 工作总结和展望 | 第128-130页 |
| §工作总结 | 第128-129页 |
| §展望 | 第129-130页 |
| 攻读博士学位期间发表和待发表的论文 | 第130-132页 |
| 致谢 | 第132-133页 |
