| 摘要 | 第1-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 缩略语 | 第12-17页 |
| 第一章 前言 | 第17-26页 |
| 1 Wnt 信号通路研究进展 | 第17-20页 |
| ·Wnt 信号通路的分类与各组分作用 | 第17-18页 |
| ·Wnt 信号通路的信号路径 | 第17-18页 |
| ·Wnt 信号通路与肿瘤的关系 | 第18-20页 |
| ·Wnt 信号通路异常引起细胞细胞增殖机制 | 第18-19页 |
| ·Wnt 信号通路拮抗蛋白基因甲基化与肝细胞癌发生 | 第19-20页 |
| ·Wnt 信号通路拮抗蛋白sFRP1 甲基化与肿瘤的发生 | 第20页 |
| ·Wnt 信号通路拮抗蛋白WIF1 甲基化与肿瘤的发生 | 第20页 |
| 2 癌症的基因治疗 | 第20-24页 |
| ·基因治疗的基因转移载体 | 第21-23页 |
| ·φC31 整合酶在癌症基因治疗中的作用 | 第23-24页 |
| 3 CHO 表达系统 | 第24-25页 |
| ·真核表达系统的优势 | 第24-25页 |
| ·CHO 表达系统的优势 | 第24-25页 |
| ·CHO 细胞的改造及表达载体的优化 | 第25页 |
| 4 课题来源 | 第25-26页 |
| 第二章 真核表达载体质粒pcHS-wif1-Fc、pcHS-Sfrp1-Fc、pcHScore-wif1-Fc、pcHScore-Sfrp1-Fc 的构建 | 第26-41页 |
| 1 实验试剂、设备与耗材 | 第26-29页 |
| ·试剂 | 第26-28页 |
| ·试剂与耗材来源 | 第26-27页 |
| ·试剂配制 | 第27-28页 |
| ·小抽所用试剂 | 第27-28页 |
| ·实验设备 | 第28-29页 |
| 2 实验方法 | 第29-36页 |
| ·实验设计及实验流程 | 第29-30页 |
| ·实验步骤 | 第30-36页 |
| ·感受态细胞的制备( CaCl_2 法) | 第30页 |
| ·转化测定转化效率 | 第30页 |
| ·计算转化率 | 第30-31页 |
| ·质粒的转化 | 第31页 |
| ·质粒PcHS-GFP、pcHScore-GFP、pad-track-wif1-Fc、pad-track-sfrp1-Fc 的小剂量抽提 | 第31-32页 |
| ·质粒的大剂量抽提与保存 | 第32-33页 |
| ·质粒PcHS-GFP、pcHScore-GFP 的酶切鉴定 | 第33页 |
| ·基因sFRP1-Fc、WIF1-Fc 的PCR 法获得 | 第33-34页 |
| ·PCR 产物的核酸电泳鉴定 | 第34-35页 |
| ·PCR 产物凝胶回收的回收 | 第35页 |
| ·质粒片段pcHS,pcHScore 的酶切 | 第35-36页 |
| ·质粒酶切片段的回收 | 第36页 |
| ·质粒片段的连接 | 第36页 |
| ·重组质粒的转化、小抽、及凝胶电泳鉴定 | 第36页 |
| 3 实验结果 | 第36-41页 |
| ·PCR 结果 | 第36-37页 |
| ·连接T 载体测序 | 第37-38页 |
| ·连接T 载体后用AgeI、XhoI 双酶切结果图 | 第38页 |
| ·质粒片段pcHS 和pcHScore 的获得 | 第38-39页 |
| ·表达载体pcHS-sFRP1-Fc、pcHScore-sFRP1-Fc、pcHSWIF1-Fc、pcHScoreWIF1-Fc 的构建 | 第39页 |
| ·质粒pcHS-sFRP1-Fc、pcHScore-sFRP1-Fc、pcHSWIF1-Fc、pcHScoreWIF1-Fc 的鉴定 | 第39-40页 |
| ·质粒结构示意图 | 第40页 |
| ·所构建质粒的大抽与定量 | 第40-41页 |
| 第三章 融合蛋白sFRP1-Fc、WIF1-Fc 的表达和纯化 | 第41-53页 |
| 1 实验试剂、设备与耗材 | 第41-45页 |
| ·实验试剂 | 第41-43页 |
| ·试剂来源实验耗材来源 | 第41页 |
| ·试剂配制 | 第41-43页 |
| ·细胞培养所需试剂 | 第41-42页 |
| ·蛋白纯化所用试剂 | 第42页 |
| ·蛋白电泳相关试剂 | 第42-43页 |
| ·实验设备 | 第43-45页 |
| 2 实验方法 | 第45-49页 |
| ·实验设计流程 | 第45页 |
| ·实验步骤 | 第45-49页 |
| ·CHO 细胞的复苏 | 第45-46页 |
| ·细胞的传代 | 第46页 |
| ·细胞的计数与铺板 | 第46页 |
| ·细胞的冻存 | 第46-47页 |
| ·G418 对CHO 细胞最小致死量的评测（Neo 抗性筛选） | 第47页 |
| ·表达载体克隆率的测定 | 第47-48页 |
| ·单克隆的筛选及扩大培养 | 第48页 |
| ·真核表达载体表达效率的测定 | 第48页 |
| ·Western-blot 鉴定表达蛋白 | 第48-49页 |
| 3 实验结果 | 第49-53页 |
| ·G418 筛选浓度的确定 | 第49-50页 |
| ·整合有目的基因的CHO 单克隆的筛选 | 第50页 |
| ·ΦC31 整合酶提高整合效率的测定 | 第50-51页 |
| ·表达载体表达能力的测定 | 第51-53页 |
| 第四章 真核表达载体对肝癌细胞的作用研究 | 第53-62页 |
| 1 实验材料 | 第53-54页 |
| ·实验设备耗材与试剂 | 第53-54页 |
| 2 实验方法 | 第54-58页 |
| ·实验设计及流程 | 第54-55页 |
| ·实验步骤 | 第55-58页 |
| ·结晶紫染色法测质粒对细胞增殖的抑制 | 第55页 |
| ·检测基因sFRP1-Fc,WIF1-Fc 对细胞增殖抑制 | 第55页 |
| ·Hoechst 染色法测质粒的促凋亡作用 | 第55-56页 |
| ·Western-blot 检测法测对癌细胞的影响 | 第56页 |
| ·总蛋白定量（BCA 法） | 第56页 |
| ·Real-time 检测法 | 第56-58页 |
| ·铺板与转染 | 第56页 |
| ·细胞总RNA 的提取 | 第56-57页 |
| ·cDNA 的合成 | 第57页 |
| ·realtime-PCR 检测细胞内相关基因mRNA 丰度 | 第57-58页 |
| 3 实验结果 | 第58-62页 |
| ·结晶紫染色观察真核表达质粒对肝癌细胞的增殖抑制作用 | 第58-59页 |
| ·hoechst 染色法观察携带有目的基因的载体对细胞的促凋亡作用 | 第59页 |
| ·western-blot 法检测细胞内信号通路的变化 | 第59-60页 |
| ·Real-time 检测suvivin,bcl-2,ctclinD1,c-myc 转录丰度 | 第60-62页 |
| 第五章 结论与讨论 | 第62-64页 |
| 参考文献 | 第64-67页 |
