利用蛋白质半理性设计提高超嗜热酯酶APE1547的活力
| 第一章 前言 | 第1-21页 |
| (一) 嗜热酶简介 | 第7-8页 |
| (二) 超嗜热酯酶APE1547 | 第8-10页 |
| 1. 酯酶简介 | 第8-9页 |
| 2. 超嗜热酯酶APE1547 | 第9-10页 |
| (三) 酶分子体外进化:理性设计与非理性设计 | 第10-16页 |
| 1. 蛋白质的理性设计 | 第10-12页 |
| 2. 蛋白质的非理性设计 | 第12-14页 |
| 3. 蛋白质半理性设计 | 第14-16页 |
| (四) 酯酶和脂肪酶的定向进化 | 第16-20页 |
| 1. 酯酶和脂肪酶的定向进化策略 | 第16-17页 |
| 2. 酯酶和脂肪酶的高通量筛选方法 | 第17-18页 |
| 3. 酯酶和脂肪酶定向进化的研究进展 | 第18-19页 |
| 4. 酯酶和脂肪酶定向进化的前景和展望 | 第19-20页 |
| (五) 立题依据和实验设计 | 第20-21页 |
| 第二章 实验材料 | 第21-28页 |
| (一) 菌种 | 第21页 |
| (二) 质粒 | 第21页 |
| (三) 主要试剂 | 第21-24页 |
| 1. 抗生素 | 第21页 |
| 2. 试剂 | 第21-23页 |
| 3. 试剂盒 | 第23页 |
| 4. 工具酶 | 第23-24页 |
| (四) 主要仪器 | 第24-25页 |
| (五) 培养基 | 第25页 |
| (六) 溶液配制 | 第25-27页 |
| (七) 常备储备液 | 第27-28页 |
| 第三章 APE1547 随机突变库的构建与筛选 | 第28-50页 |
| (一) 引言 | 第28页 |
| (二) 实验方法 | 第28-40页 |
| 1. 目的基因的制备 | 第28-30页 |
| 2. pET11a 载体DNA 的制备 | 第30-32页 |
| 3. 目的基因与载体的连接 | 第32-33页 |
| 4. APE1547 随机突变库的构建 | 第33-34页 |
| 5. APE1547 随机突变库的筛选 | 第34-35页 |
| 6. 阳性突变体的分离纯化 | 第35-36页 |
| 7. 阳性克隆的DNA 序列测定 | 第36-37页 |
| 8. 野生型及突变体酶学性质的测定 | 第37-39页 |
| 9. 突变位点的晶体结构分析 | 第39-40页 |
| (三) 实验结果 | 第40-46页 |
| 1. 随机突变库的构建 | 第40页 |
| 2. 随机突变库的突变率评估 | 第40-42页 |
| 3. 突变库的筛选及阳性突变体的确定 | 第42-44页 |
| 4. 野生型和阳性突变体酶学性质的表征 | 第44-46页 |
| (四) 讨论 | 第46-50页 |
| 1. 突变率 | 第46-47页 |
| 2. 筛选方法 | 第47页 |
| 3. 蛋白表达量变化 | 第47页 |
| 4. 晶体结构分析 | 第47-50页 |
| 第四章 特定位点饱和突变库的构建与筛选 | 第50-61页 |
| (一) 引言 | 第50-52页 |
| (二) 实验方法 | 第52-55页 |
| 1. 同源序列比对 | 第52页 |
| 2. 全质粒饱和突变PCR | 第52-53页 |
| 3. Dpn I 酶消化 | 第53页 |
| 4. 饱和突变产物的转化 | 第53页 |
| 5. 饱和突变库的构建与筛选 | 第53页 |
| 6. 阳性突变体的纯化 | 第53-54页 |
| 7. 野生型及突变体酶学性质的测定 | 第54页 |
| 8. 全质粒PCR 构建M030 突变体 | 第54-55页 |
| (三) 实验结果 | 第55-60页 |
| 1. 526 位点附近的同源序列比对 | 第55页 |
| 2. 饱和突变库的筛选及阳性突变体的确定 | 第55-57页 |
| 3. 动力学常数的测定 | 第57页 |
| 4. 突变体底物特异性 | 第57-59页 |
| 5. 最终突变体M030 的获得 | 第59-60页 |
| (四) 讨论 | 第60-61页 |
| 参考文献 | 第61-66页 |
| 作者简介 | 第66-67页 |
| 摘要 | 第67-70页 |
| Abstract | 第70-73页 |
| 致谢 | 第73页 |
