| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 缩略词 | 第7-12页 |
| 第一章 固氮基因表达调节机理的研究进展 | 第12-34页 |
| 1 前言 | 第12-13页 |
| 2 Klebsiella pneumoniae (K.p)固氮调节的分子机制 | 第13-18页 |
| ·固氮基因簇(nifcluster)的结构与功能 | 第13-14页 |
| ·固氮酶结构基因(nifHDK)操纵子的表达 | 第14-16页 |
| ·NifA正调节蛋白与NifL负调节蛋白之间的相互作用 | 第16-18页 |
| 3 Azotobacter vinelandii (A.v)固氮调节的分子机制 | 第18-20页 |
| ·固氮基因簇的结构与功能 | 第18页 |
| ·固氮酶结构基因(nifHDK)的表达调节 | 第18-19页 |
| ·调节基因(nifLA)的表达调节 | 第19页 |
| ·NifA和NifL相互作用 | 第19-20页 |
| 4 Azospirillum brasilense (A.b)固氮调节的分子机制 | 第20-24页 |
| ·固氮基因簇的定位、结构与功能 | 第20-21页 |
| ·固氮酶结构基因(nifHDK)的表达调节 | 第21-22页 |
| ·正调节基因组成型表达 | 第22页 |
| ·NifA的激活——P_Ⅱ蛋白的作用 | 第22-23页 |
| ·固氮酶活性的调节—DraT-DraG调节系统 | 第23-24页 |
| 5 不同种属固氮菌的NifL-NifA固氮调控机理的比较 | 第24-33页 |
| ·NifL结构域 | 第25-27页 |
| ·配基结合对NifL-NifA互作的影响 | 第27-28页 |
| ·固氮酶的表达调控 | 第28-30页 |
| ·NifL感应氧的调控机制 | 第30-31页 |
| ·NifL与NifA动态定位 | 第31页 |
| ·NifL抑制固氮酶的机制 | 第31-32页 |
| ·固氮菌中NifL-NifA复合物调控小结 | 第32-33页 |
| 6 本论文的立题依据 | 第33-34页 |
| 第二章 固氮调节基因nifLA的克隆及序列分析 | 第34-54页 |
| 1 材料 | 第34-36页 |
| ·菌株和质粒 | 第34-35页 |
| ·培养基与抗生素 | 第35页 |
| ·酶、试剂及试剂盒 | 第35页 |
| ·β-半乳糖苷酶活性分析试剂 | 第35-36页 |
| ·克隆nifL及nifA所用的引物 | 第36页 |
| 2 方法 | 第36-45页 |
| ·A1501菌株基因组DNA的分离 | 第36页 |
| ·A1501基因组DNA的部分酶切 | 第36-38页 |
| ·质粒载体的制备 | 第38-39页 |
| ·基因组DNA部分酶切片段与去磷酸化质粒pLA2917的连接 | 第39页 |
| ·噬菌体蛋白包装连接产物 | 第39-40页 |
| ·包装体转染大肠杆菌 | 第40页 |
| ·PCR (Polymerase Chain Reaction) | 第40页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第40页 |
| ·酶切及连接反应(Sambrook et al., 1989) | 第40-41页 |
| ·琼脂糖凝胶中DNA片段的回收 | 第41页 |
| ·Southern杂交 | 第41-43页 |
| ·高效率转化感受态细胞的制备、转化 | 第43页 |
| ·菌株固氮活性测定 | 第43-44页 |
| ·乙烯的标定 | 第44页 |
| ·β-半乳糖苷酶活性分析 | 第44-45页 |
| ·总蛋白的测定 | 第45页 |
| 3 结果与分析 | 第45-52页 |
| ·铵和氧对斯氏假单胞菌A1501固氮酶活性的影响 | 第45-46页 |
| ·铵和氧对固氮结构基因nifH表达的影响 | 第46页 |
| ·斯氏假单胞菌A1501粘粒文库的构建 | 第46-48页 |
| ·菌落PCR筛选阳性菌株 | 第48页 |
| ·Southern杂交验证阳性菌株 | 第48-49页 |
| ·nifLA-like的亚克隆 | 第49-50页 |
| ·固氮菌nifL及nifA的聚类分析 | 第50-51页 |
| ·固氮调节基因nifLA的序列分析 | 第51页 |
| ·nifL基因拷贝数的鉴定 | 第51-52页 |
| 4 讨论 | 第52-54页 |
| ·DNA文库构建 | 第52页 |
| ·基因拷贝数的鉴定 | 第52-53页 |
| ·斯氏假单胞菌A1501中不存在大质粒 | 第53-54页 |
| 第三章 固氮调节基因nifL和nifA的功能研究 | 第54-69页 |
| 1 材料 | 第55-56页 |
| ·菌株和质粒 | 第55-56页 |
| ·酶、试剂和试剂盒 | 第56页 |
| ·引物 | 第56页 |
| 2 方法 | 第56-57页 |
| ·细菌总RNA的提取 | 第56-57页 |
| ·第一链cDNA的合成 | 第57页 |
| ·其它的实验方法 | 第57页 |
| 3 结果与分析 | 第57-68页 |
| ·固氮调节基因nifL极性与非极性突变株的构建 | 第57-61页 |
| ·nifA突变株和nifL突变株的固氮表型 | 第61-62页 |
| ·RT-PCR验证nifL突变株中NifA的表达 | 第62-63页 |
| ·nifA组成性表达质粒pVA3的构建 | 第63-64页 |
| ·重组质粒pVA3对A1501野生型及突变株固氮酶活性的影响 | 第64-65页 |
| ·nifL组成性表达质粒pVL的构建 | 第65页 |
| ·重组质粒pVL对A1501突变株及野生型固氮酶活性的影响 | 第65-66页 |
| ·过量表达的NifA及NifL蛋白对固氮酶转录活性的影响 | 第66-67页 |
| ·不同转录因子对固氮酶表达活性的影响 | 第67-68页 |
| 4 讨论 | 第68-69页 |
| ·P. stutzeri A1501中是否存在DraT-DraG调节系统 | 第68页 |
| ·利用RT-PCR鉴定基因的转录 | 第68-69页 |
| 第四章 利用酵母双杂交系统研究NifA与NifL的互作 | 第69-86页 |
| 1 材料 | 第69-72页 |
| ·菌株和质粒 | 第69-71页 |
| ·酵母培养基 | 第71页 |
| ·酵母转化用溶液及缓冲液 | 第71页 |
| ·其它的实验方法 | 第71页 |
| ·引物 | 第71-72页 |
| 2 酵母双杂交系统的原理 | 第72-74页 |
| 3 方法 | 第74-76页 |
| ·酵母感受态细胞的制备及转化 | 第74-75页 |
| ·酵母质粒DNA的提取 | 第75页 |
| ·β-半乳糖甘酶活性滤纸分析 | 第75-76页 |
| ·β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase)活性的测定 | 第76页 |
| 4 结果与分析 | 第76-84页 |
| ·NifA，NifL及其不同结构域重组质粒的构建 | 第76-81页 |
| ·NifL蛋白与NifA蛋白之间相互作用的研究 | 第81页 |
| ·NifL蛋白与NifA蛋白之间作用区域的定位 | 第81-83页 |
| ·NifL蛋白与NifA蛋白结构域 | 第83-84页 |
| 5 讨论 | 第84-86页 |
| ·酵母双杂交系统已成为研究蛋白互作的重要手段 | 第84-85页 |
| ·斯氏假单胞菌中存在一个NifL-NifA调控系统 | 第85-86页 |
| 第五章 NifL与NifA的体外互作 | 第86-100页 |
| 1 材料 | 第86-89页 |
| ·菌株和质粒 | 第86-87页 |
| ·SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液及缓冲液 | 第87页 |
| ·酶，试剂及主要仪器 | 第87页 |
| ·蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第87-88页 |
| ·纯化His-Tag融合蛋白的NTA缓冲液的配制 | 第88页 |
| ·GST重组蛋白质亲和纯化(GSH-Sepharose)缓冲液的配制 | 第88-89页 |
| ·引物 | 第89页 |
| 2 方法 | 第89-93页 |
| ·融合蛋白的诱导表达及SDS-PAGE分析 | 第89页 |
| ·可溶性分析 | 第89-90页 |
| ·发酵时间的优化 | 第90页 |
| ·NifA-His融合蛋白的纯化 | 第90页 |
| ·GST-NifLc融合蛋白的纯化 | 第90-91页 |
| ·在谷胱甘肽层析柱中的细胞外蛋白结合实验 | 第91页 |
| ·在NTA层析柱中细胞外蛋白结合实验 | 第91页 |
| ·以T7·Tag Antibody AP Conjugate为抗体的蛋白杂交程序 | 第91-92页 |
| ·以GST·Tag Antibody AP Conjugate为抗体的蛋白杂交程序 | 第92-93页 |
| 3 结果与分析 | 第93-98页 |
| ·pET28a-NifA融合表达载体pETA的构建 | 第93-94页 |
| ·pGEX2T-NifLc融合表达载体pGLc的构建 | 第94-95页 |
| ·融合蛋白的诱导表达及发酵时间的优化 | 第95-96页 |
| ·融合蛋白的可溶性分析 | 第96-97页 |
| ·SDS-PAGE确定目标蛋白在洗脱液中的分布情况及大量纯化 | 第97页 |
| ·分别以T7·Tag抗体和GST·Tag抗体检测NifL与NifA在细胞外的结合 | 第97-98页 |
| 4 讨论 | 第98-100页 |
| 第六章 固氮斯氏假单胞菌nifLA基因表达的调控机制研究 | 第100-108页 |
| 1 材料 | 第100-101页 |
| ·菌株和质粒 | 第100-101页 |
| ·酶、试剂和试剂盒 | 第101页 |
| ·引物 | 第101页 |
| 2 方法 | 第101-102页 |
| 3 结果与分析 | 第102-105页 |
| ·nifLAp-lacZ融合表达载体的构建过程 | 第102-103页 |
| ·固氮斯氏假单胞菌nifLA基因启动区的克隆 | 第103页 |
| ·nifLA基因启动子片段克隆到pLA2917载体上 | 第103页 |
| ·lacZ-Km盒克隆到nifLA启动子后的编码区 | 第103-104页 |
| ·nifLAp-lacZ融合基因在野生型菌株及突变菌株中的表达 | 第104页 |
| ·ONPG法定量测定结合子的β-半乳糖苷酶活性 | 第104-105页 |
| 4 讨论 | 第105-108页 |
| ·NifA是固氮菌的转录激活蛋白 | 第105页 |
| ·nifLA调控不同固氮菌的异同 | 第105-106页 |
| ·斯氏假单胞菌固氮基因的转录调控模式 | 第106-108页 |
| 第七章 结论 | 第108-109页 |
| 1 本论文的工作中得到的确定结果 | 第108页 |
| 2 本项研究的创新点 | 第108-109页 |
| 参考文献 | 第109-123页 |
| 致谢 | 第123-124页 |
| 附录1.A1501固氮调节基因nifLA的核苷酸序列及推断的开放读码框 | 第124-127页 |
| 附录2.斯氏假单胞菌nifLA基因启动子区 | 第127-128页 |
| 附录3.重组质粒pET28a-nifL的构建流程 | 第128-129页 |
| 附录4.pGAD-nifA，pGAD-nifL，pGAD-nifAm质粒构建图 | 第129-130页 |
| 附录5.重组质粒pGBD-nifA，pGBD-nifL和pGBD-nifLc的构建 | 第130-131页 |
| 个人简介 | 第131页 |
