| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-11页 |
| 引言 | 第11-12页 |
| 1 文献综述 | 第12-34页 |
| ·埃博霉素概述 | 第12-14页 |
| ·埃博霉素简介 | 第12页 |
| ·发现和发展 | 第12-14页 |
| ·天然埃博霉素 | 第14-17页 |
| ·分离和大规模生产 | 第14-15页 |
| ·结构和相关化合物 | 第15页 |
| ·物理和化学性质 | 第15-16页 |
| ·抗肿瘤机制研究 | 第16-17页 |
| ·埃博霉素的生物合成和异源表达 | 第17-21页 |
| ·生物合成基因的确定 | 第17-19页 |
| ·生物合成机制的研究 | 第19-20页 |
| ·异源表达研究 | 第20-21页 |
| ·埃博霉素的全合成、半合成和构效关系研究 | 第21-22页 |
| ·全合成研究 | 第21页 |
| ·相关衍生物的半合成 | 第21-22页 |
| ·构效关系研究 | 第22页 |
| ·埃博霉素的临床研究进展 | 第22-24页 |
| ·埃博霉素B及其衍生物 | 第23-24页 |
| ·埃博霉素D及其衍生物 | 第24页 |
| ·细胞色素P450酶的研究 | 第24-29页 |
| ·细胞色素P450酶概述 | 第24-27页 |
| ·链霉菌P450酶的研究 | 第27-28页 |
| ·埃博霉素P450epoK酶的研究 | 第28-29页 |
| ·生物转化研究 | 第29-31页 |
| ·野生菌全细胞催化 | 第29-30页 |
| ·基因工程全细胞反应 | 第30-31页 |
| ·生物催化剂的改造 | 第31页 |
| ·立题依据和主要内容 | 第31-34页 |
| ·立题依据 | 第31-32页 |
| ·主要内容 | 第32-34页 |
| 2 EpoK基因在大肠杆菌中的异源表达 | 第34-54页 |
| ·引言 | 第34页 |
| ·实验材料 | 第34-36页 |
| ·菌种和质粒 | 第34页 |
| ·主要实验试剂 | 第34-36页 |
| ·主要实验仪器 | 第36页 |
| ·实验方法 | 第36-44页 |
| ·培养基及溶液配制 | 第36-38页 |
| ·SDS碱裂解法小量制备质粒DNA | 第38页 |
| ·引物设计及PCR扩增 | 第38-39页 |
| ·质粒的双酶切 | 第39-40页 |
| ·目的DNA片段的回收 | 第40页 |
| ·目的片段的连接 | 第40页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第40-41页 |
| ·热激法转化大肠杆菌细胞 | 第41页 |
| ·转化子的鉴定 | 第41页 |
| ·目的蛋白的诱导表达 | 第41-42页 |
| ·表达样品的处理 | 第42页 |
| ·SDS-PAGE | 第42-43页 |
| ·目的蛋白的纯化 | 第43-44页 |
| ·酶的体外反应和活性检测 | 第44页 |
| ·结果与讨论 | 第44-53页 |
| ·PCR扩增目的基因 | 第44页 |
| ·T克隆载体的构建 | 第44-45页 |
| ·表达载体的构建 | 第45-49页 |
| ·目的蛋白的诱导表达 | 第49-52页 |
| ·酶的体外反应和活性检测 | 第52-53页 |
| ·本章小结 | 第53-54页 |
| 3 EpoK基因在链霉菌中的异源表达及催化 | 第54-70页 |
| ·引言 | 第54页 |
| ·实验材料 | 第54-56页 |
| ·菌种和质粒 | 第54-55页 |
| ·主要实验试剂 | 第55-56页 |
| ·主要实验仪器 | 第56页 |
| ·实验方法 | 第56-60页 |
| ·培养基及溶液配制 | 第56-57页 |
| ·引物设计及PCR扩增 | 第57-58页 |
| ·重组质粒的构建及大肠杆菌的转化 | 第58页 |
| ·链霉菌原生质体的制备 | 第58-59页 |
| ·链霉菌原生质体转化 | 第59页 |
| ·转化子的挑选及鉴定 | 第59页 |
| ·链霉菌孢子的保存方法 | 第59页 |
| ·底物的生物转化 | 第59页 |
| ·样品的处理及检测 | 第59-60页 |
| ·转化率的计算 | 第60页 |
| ·结果与讨论 | 第60-69页 |
| ·epoK基因的克隆与构建 | 第60-61页 |
| ·链霉菌原生质体转化 | 第61-62页 |
| ·EpoD的生物转化 | 第62-64页 |
| ·BG44A和BG44B的生物转化 | 第64-65页 |
| ·转化EpoD进行条件优化 | 第65-68页 |
| ·优化后转化BG44A和BG44B | 第68-69页 |
| ·本章小结 | 第69-70页 |
| 4 EpoK基因的定点突变 | 第70-78页 |
| ·引言 | 第70页 |
| ·实验材料 | 第70页 |
| ·菌种和质粒 | 第70页 |
| ·主要实验试剂 | 第70页 |
| ·主要实验仪器 | 第70页 |
| ·实验方法 | 第70-73页 |
| ·培养基及溶液的配制 | 第70-71页 |
| ·快速PCR定点突变技术原理 | 第71-72页 |
| ·突变引物的设计 | 第72-73页 |
| ·突变PCR | 第73页 |
| ·重组载体的构建及转化 | 第73页 |
| ·底物的生物转化及样品检测 | 第73页 |
| ·结果与讨论 | 第73-77页 |
| ·突变位点的确定 | 第73-74页 |
| ·epoK-pUC19克隆载体的构建 | 第74页 |
| ·突变PCR | 第74页 |
| ·epoK突变体-pWHM3表达载体的构建 | 第74-76页 |
| ·底物的生物转化及样品检测 | 第76-77页 |
| ·本章小结 | 第77-78页 |
| 结论 | 第78-79页 |
| 参考文献 | 第79-88页 |
| 附录A EpoB、BG44A-O和BG44B-O的ESI-MS谱图 | 第88-89页 |
| 附录B EpoB的~1H NMR谱图 | 第89-90页 |
| 附录C BG44A-O的~1H NMR谱图 | 第90-91页 |
| 附录D BG44B-O的~1HNMR谱图 | 第91-92页 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 | 第92-93页 |
| 致谢 | 第93-94页 |