| 中文摘要 | 第1-5页 |
| 英文摘要 | 第5-13页 |
| 1 绪 论 | 第13-29页 |
| ·问题的提出 | 第13-24页 |
| ·RNAi 的发现 | 第13页 |
| ·RNAi 相关现象的机理研究 | 第13-15页 |
| ·RNAi 的机理研究 | 第15-18页 |
| ·miRNA (microRNA) | 第18-20页 |
| ·RNAi 通路的生理功能 | 第20-24页 |
| ·本论文拟解决的问题 | 第24页 |
| ·国内外研究的现状 | 第24-26页 |
| ·遗传印迹与 RNA 干扰的研究进展 | 第24页 |
| ·Dicer 与基因组的稳定性之间的关系 | 第24-25页 |
| ·DNA 损伤与 NKG2D 配体的关系 | 第25-26页 |
| ·DNA 损伤与纤维粘连蛋白的关系 | 第26页 |
| ·本文研究的目的、意义以及主要内容 | 第26-29页 |
| ·本文研究目的及意义 | 第26-27页 |
| ·本文研究的主要内容 | 第27-29页 |
| 2 Dicer 调节印迹基因 PHLDA2 的表达及染色质结构 | 第29-51页 |
| ·引言 | 第29-30页 |
| ·实验材料 | 第30-32页 |
| ·实验细胞 | 第30页 |
| ·主要仪器设备 | 第30页 |
| ·主要实验试剂 | 第30-31页 |
| ·主要试剂配制 | 第31-32页 |
| ·实验方法 | 第32-42页 |
| ·细胞培养 | 第32页 |
| ·RNA 干扰 | 第32-34页 |
| ·生长抑制试验 | 第34页 |
| ·Western 蛋白印迹 | 第34-36页 |
| ·荧光定量 RT-PCR | 第36-37页 |
| ·mRNA Northern 印迹 | 第37-39页 |
| ·miRNA Northern 印迹 | 第39页 |
| ·染色质免疫沉淀(chromatin inmmunoprecipitation, CHIP) | 第39-40页 |
| ·亚硫酸盐序列分析 | 第40-42页 |
| ·统计分析 | 第42页 |
| ·实验结果 | 第42-46页 |
| ·应用特异的 siRNA 干扰 Dicer 的表达 | 第42-43页 |
| ·干扰 Dicer 的表达抑制 miRNA 的产生 | 第43页 |
| ·PHLDA2 在 Dicer 下调的细胞中表达增加 | 第43-44页 |
| ·PHLDA2 启动子区 H3K9 乙酰化水平在 Dicer knockdown 细胞中增加 | 第44-45页 |
| ·PHLDA2 启动子区的 DNA 甲基化水平不受 Dicer knockdown 的影响 | 第45页 |
| ·PHLDA2 的上调不是生长抑制的结果 | 第45-46页 |
| ·分析讨论 | 第46-49页 |
| ·本章小结 | 第49-51页 |
| 3 抑制 Dicer 的表达诱发 DNA 损伤 | 第51-65页 |
| ·引言 | 第51页 |
| ·实验材料 | 第51-52页 |
| ·实验细胞 | 第51页 |
| ·主要仪器设备 | 第51页 |
| ·主要实验试剂 | 第51-52页 |
| ·实验方法 | 第52-54页 |
| ·细胞培养 | 第52页 |
| ·RNA 干扰 | 第52页 |
| ·蛋白印迹 | 第52页 |
| ·荧光定量 RT-PCR | 第52页 |
| ·染色质免疫沉淀 | 第52-53页 |
| ·彗星电泳 | 第53页 |
| ·细胞免疫组化 | 第53-54页 |
| ·实验结果 | 第54-60页 |
| ·应用不同的 siRNA 抑制 Dicer 的表达 | 第54页 |
| ·抑制 Dicer 的表达导致 γ-H2AX foci 阳性率增高 | 第54-55页 |
| ·抑制 Dicer 的表达导致 RPA foci 阳性率增高 | 第55-56页 |
| ·抑制 Dicer 的表达并不改变细胞周期的分布 | 第56-57页 |
| ·抑制 Dicer 的表达引起检验点激酶 1(Chk1)磷酸化 | 第57-58页 |
| ·单细胞凝胶电泳显示抑制 Dicer 的表达引起 DNA 断裂 | 第58页 |
| ·抑制 Dicer 的表达引起 GADD45A、GADD45B、p21、BTG3、ATF3 和 EGR1的 mRNA 水平升高 | 第58-59页 |
| ·抑制 Dicer 的表达引起 GADD45A、GADD45B、p21、BTG3、ATF3 和 EGR1的转录水平增加 | 第59-60页 |
| ·分析讨论 | 第60-63页 |
| ·降低 Dicer 表达通过异染色质解凝聚诱导 DNA 损伤 | 第60-62页 |
| ·降低 Dicer 表达可能通过增加转座元件转录本的稳定性来诱导 DNA 损伤 | 第62页 |
| ·降低 Dicer 表达诱导 DNA 损伤,但为什么不改变细胞周期的分布? | 第62-63页 |
| ·本章小结 | 第63-65页 |
| 4 Dicer 调节天然免疫分子 MICA 和 MICB 的表达 | 第65-81页 |
| ·引言 | 第65-66页 |
| ·实验材料 | 第66-67页 |
| ·实验细胞 | 第66页 |
| ·主要仪器设备 | 第66页 |
| ·主要实验试剂 | 第66-67页 |
| ·实验方法 | 第67-68页 |
| ·RNA 干扰 | 第67页 |
| ·蛋白印迹 | 第67页 |
| ·荧光定量 RT-PCR | 第67页 |
| ·细胞杀伤实验 | 第67-68页 |
| ·实验结果 | 第68-75页 |
| ·抑制 Dicer 表达诱导 MICA 和 MICB 的表达 | 第68页 |
| ·Dicer 表达降低的细胞对 NKL 细胞的杀伤作用更敏感 | 第68-70页 |
| ·Dicer 表达降低诱导的 MICA 和 MICB 表达能够被咖啡因抑制 | 第70-71页 |
| ·Dicer 表达降低诱导的 MICA 和 MICB 表达能够被 staurosporine 抑制 | 第71-72页 |
| ·干扰 ATM、ATR 和 Chk1 的表达能够部分抑制 Dicer knockdown 细胞中的 MICA和 MICB 表达 | 第72页 |
| ·在 Dicer knockdown 的细胞中,DNA 损伤程度与 MICA 和 MICB基因的上调幅度成正相关 | 第72-73页 |
| ·MICA 和 MICB 的上调可能主要是对双链 DNA 断裂的反映 | 第73页 |
| ·MICA 和 MICB 的上调不是 Dicer siRNA 非特异性地激活哺乳动物免疫系统的结果 | 第73-75页 |
| ·Dicer 缺失的细胞中 MICA 和 MICB 的转录增加 | 第75页 |
| ·分析讨论 | 第75-79页 |
| ·本章小结 | 第79-81页 |
| 5 5-脱氧氮杂胞苷诱导 MICB 的表达 | 第81-89页 |
| ·引言 | 第81页 |
| ·实验材料 | 第81页 |
| ·实验细胞 | 第81页 |
| ·主要仪器设备 | 第81页 |
| ·主要实验试剂 | 第81页 |
| ·实验方法 | 第81-82页 |
| ·RNA 干扰 | 第81-82页 |
| ·荧光定量 RT-PCR | 第82页 |
| ·亚硫酸盐序列分析 | 第82页 |
| ·实验结果 | 第82-86页 |
| ·5-脱氧氮杂胞苷处理诱导 MICB 的表达 | 第82页 |
| ·5-脱氧氮杂胞苷增加了细胞对 NKL 介导的溶解作用的敏感性 | 第82-84页 |
| ·5-脱氧氮杂胞苷诱导 MICB 启动子区去甲基化 | 第84页 |
| ·DNA 损伤途径可能也参与 5-脱氧氮杂胞苷诱导的 MICB 表达 | 第84-86页 |
| ·分析讨论 | 第86-88页 |
| ·本章小结 | 第88-89页 |
| 6 抑制 Dicer 表达诱导 EGR1 依赖的纤维粘连蛋白表达上调 | 第89-101页 |
| ·引言 | 第89页 |
| ·实验材料 | 第89-90页 |
| ·实验细胞 | 第89页 |
| ·主要仪器设备 | 第89页 |
| ·主要实验试剂 | 第89-90页 |
| ·实验方法 | 第90-92页 |
| ·RNA 干扰 | 第90页 |
| ·细胞迁移实验 | 第90页 |
| ·ELISA | 第90-91页 |
| ·荧光定量 RT-PCR | 第91页 |
| ·RNAPol-ChIP | 第91页 |
| ·Caspase-3 活性检测 | 第91-92页 |
| ·Annexin-V-FITC assay | 第92页 |
| ·实验结果 | 第92-99页 |
| ·Dicer 下调影响 HEK293T 细胞的迁移能力 | 第92-93页 |
| ·Dicer 下调引起纤维粘连蛋白表达增加 | 第93-94页 |
| ·Dicer 下调引起的细胞迁移能力降低是纤维粘连蛋白表达增加的结果 | 第94-95页 |
| ·整合素 α5 在 Dicer 下调的细胞中没有显著改变 | 第95-96页 |
| ·在 Dicer 下调的 HEK293T 细胞中, EGR1 对诱导纤维粘连蛋白的表达是必需的 | 第96页 |
| ·抑制 EGR1 的表达能够部分逆转 Dicer knockdown 导致的细胞迁移能力降低 | 第96-97页 |
| ·在 Dicer 下调的 HEK293T 细胞中, 抑制纤维粘连蛋白的表达可诱导细胞凋亡 | 第97-99页 |
| ·结果讨论 | 第99-100页 |
| ·本章小结 | 第100-101页 |
| 7 结论与展望 | 第101-103页 |
| ·主要结论 | 第101-102页 |
| ·后续研究工作展望 | 第102-103页 |
| 致谢 | 第103-105页 |
| 参考文献 | 第105-119页 |
| 附录 | 第119-120页 |
| A. 攻读博士学位期间发表的部分论文目录 | 第119-120页 |
| B. 作者在攻读博士学位期间参加的科研项目 | 第120页 |
