| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 缩略词表 | 第13-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-31页 |
| 1 植物MADS-box家族基因 | 第14-20页 |
| 1.1 植物MADS-box家族基因结构 | 第14页 |
| 1.2 植物MADS-box家族基因与花发育 | 第14-20页 |
| 1.2.1 STMADS11亚家族 | 第16-17页 |
| 1.2.2 FLC亚家族 | 第17-20页 |
| 2 CRISPR-Cas系统 | 第20-21页 |
| 3 转座子概述 | 第21-28页 |
| 3.1 转座子的分类 | 第22-23页 |
| 3.2 转座子遗传效应及应用 | 第23-24页 |
| 3.3 植物中的转座系统 | 第24-28页 |
| 3.3.1 矮牵牛的转座系统 | 第25-28页 |
| 3.3.1.1 矮牵牛的Act-dTph1转座系统 | 第25-27页 |
| 3.3.1.2 矮牵牛其它转座元件 | 第27-28页 |
| 4 转座子差异显示技术(Transposon Display) | 第28-30页 |
| 5 本研究的目的与意义 | 第30-31页 |
| 第二章 矮牵牛RNA靶向的基因组定向编辑技术-CRISPR-Cas9测试系统 | 第31-39页 |
| 1 引言 | 第31页 |
| 2 材料与方法 | 第31-36页 |
| 2.1 植物材料 | 第31页 |
| 2.2 主要试剂、载体 | 第31-32页 |
| 2.3 培养基 | 第32页 |
| 2.4 实验方法 | 第32-36页 |
| 2.4.1 PDS基因克隆与CRISPR-Cas9载体构建 | 第33-36页 |
| 2.4.1.1 基因编辑位点 | 第33页 |
| 2.4.1.2 引物设计 | 第33页 |
| 2.4.1.3 目的片段的扩增与回收 | 第33-34页 |
| 2.4.1.4 A-T克隆 | 第34页 |
| 2.4.1.5 热激转化大肠杆菌 | 第34-35页 |
| 2.4.1.6 质粒酶切及载体连接 | 第35页 |
| 2.4.1.7 重组质粒转化AGL0农杆菌菌株以及GV3101农杆菌菌株 | 第35-36页 |
| 2.4.2 叶盘法转化矮牵牛及PCR阳性检测 | 第36页 |
| 3 结果与分析 | 第36-38页 |
| 3.1 PDS-CRISPR-Cas9载体构建 | 第36-37页 |
| 3.1.1 目的片段扩增 | 第36页 |
| 3.1.2 重组质粒酶切检测 | 第36-37页 |
| 3.2 PDS-CRISPR-Cas9载体转化矮牵牛 | 第37-38页 |
| 3.2.1 转基因植株PCR检测 | 第37页 |
| 3.2.2 转基因植株表型 | 第37-38页 |
| 4 分析与讨论 | 第38-39页 |
| 第三章 矮牵牛STMADS11和FLC亚家族基因功能分析 | 第39-65页 |
| 1 引言 | 第39-40页 |
| 2 材料与方法 | 第40-46页 |
| 2.1 植物材料 | 第40页 |
| 2.2 主要仪器、试剂 | 第40页 |
| 2.3 培养基 | 第40页 |
| 2.4 实验方法 | 第40-46页 |
| 2.4.1 STMADS11和FLC亚家族基因克隆与载体构建 | 第40-43页 |
| 2.4.1.1 引物设计 | 第40-41页 |
| 2.4.1.2 RNA提取及反转录 | 第41页 |
| 2.4.1.3 获取目的片段 | 第41-42页 |
| 2.4.1.4 系统进化树分析 | 第42页 |
| 2.4.1.5 超表载体和CRISPR-Cas9载体构建原理 | 第42-43页 |
| 2.4.1.6 热激转化大肠杆菌、质粒酶切及载体连接 | 第43页 |
| 2.4.1.7 重组质粒转化AGLO、GV3101农杆菌菌株 | 第43页 |
| 2.4.2 STMADS11亚家族与FLC亚家族蛋白互作 | 第43-44页 |
| 2.4.2.1 基因酵母双杂交载体的构建 | 第43-44页 |
| 2.4.2.2 重组质粒转化酵母AH109 | 第44页 |
| 2.4.2.3 酵母互作检测 | 第44页 |
| 2.4.3 STMADS11和FLC亚家族基因转化拟南芥 | 第44-45页 |
| 2.4.3.1 野生型拟南芥播种、侵染及阳性苗筛选 | 第44-45页 |
| 2.4.3.2 T1代拟南芥表型观测 | 第45页 |
| 2.4.3.3 T2代阳性苗表型观测 | 第45页 |
| 2.4.4 STMADS11和FLC亚家族基因转化矮牵牛 | 第45-46页 |
| 3 结果与分析 | 第46-62页 |
| 3.1 STMADS11和FLC亚家族基因克隆与载体构建 | 第46-50页 |
| 3.1.1 矮牵牛提取RNA的质量检测 | 第46页 |
| 3.1.2 目的基因的克隆 | 第46-48页 |
| 3.1.3 系统进化树分析 | 第48-50页 |
| 3.1.4 重组质粒酶切检测 | 第50页 |
| 3.2 FLC和STMADS11酵母互作实验 | 第50-54页 |
| 3.2.1 酵母互作结果统计 | 第50-52页 |
| 3.2.2 X-α-gal显色反应 | 第52-54页 |
| 3.3 STMADS11和FLC亚家族基因转化拟南芥表型 | 第54-58页 |
| 3.3.1 T1代拟南芥转基因植株表型 | 第54-57页 |
| 3.3.2 T2代表拟南芥转基因植株表型 | 第57-58页 |
| 3.4 STMADS11和FLC亚家族基因功能 | 第58-62页 |
| 3.4.1 转基因阳性株系数目 | 第58-59页 |
| 3.4.2 超表转基因植株 | 第59-61页 |
| 3.4.3 CRISPR-Cas9载体转基因植株 | 第61-62页 |
| 4 分析与讨论 | 第62-65页 |
| 4.1 STMADS11亚家族和FLC亚家族蛋白互作 | 第62页 |
| 4.2 拟南芥转化与功能验证 | 第62-63页 |
| 4.3 矮牵牛STMADS11和FLC亚家族基因功能 | 第63-65页 |
| 第四章 基于dTph1转座子插入的矮牵牛不育突变体遗传机理分析 | 第65-86页 |
| 1 引言 | 第65页 |
| 2 材料与方法 | 第65-75页 |
| 2.1 植物材料 | 第65-66页 |
| 2.2 主要仪器及试剂 | 第66-67页 |
| 2.3 实验方法 | 第67-75页 |
| 2.3.1 SDS法提取基因组DNA | 第69-70页 |
| 2.3.2 转座子差异显示技术-产物扩增 | 第70-75页 |
| 2.3.2.1 接头合成 | 第70页 |
| 2.3.2.2 基因组酶切 | 第70-71页 |
| 2.3.2.3 酶切片段接头连接 | 第71页 |
| 2.3.2.4 产物的稀释 | 第71页 |
| 2.3.2.5 预扩增 | 第71-72页 |
| 2.3.2.6 选择性扩增 | 第72-73页 |
| 2.3.2.7 选择性扩增产物变性处理 | 第73-74页 |
| 2.3.2.8 转座子差异显示技术-产物扩增 | 第74页 |
| 2.3.2.9 目标片段的富集、回收、鉴定 | 第74-75页 |
| 3 实验结果与分析 | 第75-84页 |
| 3.1 突变体群体建立以及遗传规律分析 | 第75-80页 |
| 3.2 突变植株及正常植株的DNA提取 | 第80-81页 |
| 3.3 转座子差异显示技术 | 第81-84页 |
| 4 讨论 | 第84-86页 |
| 4.1 突变体与纯合正常体群体的建立 | 第84页 |
| 4.2 转座子差异显示技术 | 第84-86页 |
| 4.2.1 基因组DNA酶切 | 第84页 |
| 4.2.2 预扩增和选择性扩增 | 第84-85页 |
| 4.2.3 聚丙烯酰胺电泳检测 | 第85页 |
| 4.2.4 目的片段回收 | 第85-86页 |
| 参考文献 | 第86-97页 |
| 附录 | 第97-102页 |
| 致谢 | 第102页 |
