| 摘要 | 第7-8页 |
| 1 前言 | 第8-18页 |
| 1.1 叶绿素生物合成途径 | 第8-10页 |
| 1.1.1 四吡咯途径 | 第8-9页 |
| 1.1.2 MEP途径 | 第9-10页 |
| 1.2 叶绿素降解途径 | 第10页 |
| 1.3 叶绿素合成的调控 | 第10-11页 |
| 1.4 丙酮酸脱氢酶复合体(PDC)的组成 | 第11-14页 |
| 1.4.1 丙酮酸脱氢酶E1 | 第11-12页 |
| 1.4.2 二氢硫辛酸乙酰转移酶E2 | 第12-14页 |
| 1.4.3 二氢硫辛酸脱氢酶E3 | 第14页 |
| 1.5 丙酮酸脱氢酶复合体的作用机理及活性调节 | 第14-17页 |
| 1.5.1 丙酮酸脱氢酶复合体(PDC)的作用机理 | 第14-15页 |
| 1.5.2 丙酮酸脱氢酶复合体(PDC)的活性调节 | 第15-17页 |
| 1.5.2.1 线粒体丙酮酸脱氢酶复合体(mtPDC)的活性调节 | 第15-16页 |
| 1.5.2.2 叶绿体丙酮酸脱氢酶复合体(plPDC)的活性调节 | 第16-17页 |
| 1.6 研究的目的和意义 | 第17-18页 |
| 2 材料和方法 | 第18-33页 |
| 2.1 试验材料 | 第18-22页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第18页 |
| 2.1.2 试剂 | 第18页 |
| 2.1.3 质粒、菌株和载体 | 第18页 |
| 2.1.4 主要仪器与设备 | 第18-19页 |
| 2.1.5 常用培养基和试剂的配制 | 第19页 |
| 2.1.6 DNA提取液 | 第19页 |
| 2.1.7 蛋白实验的溶液及缓冲液配制 | 第19-21页 |
| 2.1.8 农杆菌侵染和烟草瞬时表达所需试剂的配制 | 第21页 |
| 2.1.9 分离拟南芥原生质体试剂的制配 | 第21-22页 |
| 2.2 试验方法 | 第22-33页 |
| 2.2.1 At1g54220、At3g13930和At3g5220拟南芥转基因材料的获得 | 第22-23页 |
| 2.2.1.1 拟南芥转化材料的制备 | 第22页 |
| 2.2.1.2 农杆菌电击感受态细胞的制备 | 第22-23页 |
| 2.2.1.3 电击农杆菌感受态细胞的转化 | 第23页 |
| 2.2.1.4 农杆菌侵染拟南芥花序的方法 | 第23页 |
| 2.2.2 转基因材料的筛选 | 第23-24页 |
| 2.2.3 LUC荧光素底物发光检测基因的表达 | 第24页 |
| 2.2.4 在转录水平对阳性植株的鉴定 | 第24-25页 |
| 2.2.4.1 TRNzol法提取总RNA | 第24页 |
| 2.2.4.2 RNA琼脂糖电泳检测 | 第24页 |
| 2.2.4.3 反转录程序 | 第24页 |
| 2.2.4.4 荧光定量PCR(Real-Time PCR)技术检测是否过表达 | 第24-25页 |
| 2.2.5 在蛋白水平对阳性植株的鉴定 | 第25-26页 |
| 2.2.6 单拷贝检测及纯合体的获得 | 第26页 |
| 2.2.7 叶绿素含量测定方法 | 第26页 |
| 2.2.8 叶绿素合成前体的测定 | 第26-27页 |
| 2.2.8.1 叶绿素前体胆色素原的测定 | 第26-27页 |
| 2.2.8.2 叶绿素前体原卟啉Ⅸ和Mg-原卟啉Ⅸ的测定 | 第27页 |
| 2.2.9 GATEWAY系统载体构建 | 第27-30页 |
| 2.2.9.1 引物的设计 | 第27页 |
| 2.2.9.2 Gateway Technology with Clonase~(TM) Ⅱ克隆 | 第27-28页 |
| 2.2.9.3 PCR产物的回收 | 第28页 |
| 2.2.9.4 GATEWAY Binary中间载体与目的片段的BP连接反应 | 第28页 |
| 2.2.9.5 大肠杆菌(DH5α)的热击转化 | 第28-29页 |
| 2.2.9.6 阳性菌落PCR鉴定 | 第29页 |
| 2.2.9.7 阳性质粒的提取 | 第29-30页 |
| 2.2.9.8 测序 | 第30页 |
| 2.2.9.9 LR连接反应 | 第30页 |
| 2.2.10 YEL过表达材料的获得 | 第30页 |
| 2.2.11 YEL亚细胞定位 | 第30-31页 |
| 2.2.11.1 注射烟草瞬时表达 | 第30-31页 |
| 2.2.11.2 拟南芥原生质体的制备和转化 | 第31页 |
| 2.2.12 YEL RNAi材料的获得 | 第31-32页 |
| 2.2.13 CRISPER技术干扰材料的获得 | 第32页 |
| 2.2.14 YEL的T-DNA插入突变体纯合子鉴定 | 第32-33页 |
| 3 结果和分析 | 第33-44页 |
| 3.1 Atlg54220与线粒体丙酮酸脱氢酶E2亚基高度同源 | 第33-34页 |
| 3.2 转基因YEL植株表现出叶黄化表型 | 第34-35页 |
| 3.3 YEL表达量在转基因植株中明显升高 | 第35-36页 |
| 3.4 YEL转基因植株叶绿素a和b含量降低 | 第36-37页 |
| 3.5 YEL转基因植株叶绿素合成前体含量降低 | 第37-38页 |
| 3.6 YEL-FLAG转基因植株叶绿素降低 | 第38-39页 |
| 3.6.1 YEL基因的扩增 | 第38页 |
| 3.6.2 转基因材料表型出现黄化 | 第38-39页 |
| 3.7 YEL亚细胞定位 | 第39-40页 |
| 3.8 YEL干扰载体构建 | 第40-41页 |
| 3.9 CRISPER技术干扰载体构建 | 第41-42页 |
| 3.10 YEL的T-DNA插入突变体 | 第42-44页 |
| 4 讨论 | 第44页 |
| 5 结论 | 第44页 |
| 6 本研究的后续补充实验 | 第44-46页 |
| 参考文献 | 第46-53页 |
| Abstract | 第53页 |
| 研究生期间发表论文 | 第55-57页 |
| 致谢 | 第57页 |
