| 摘要 | 第9-11页 |
| ABSTRACT | 第11-13页 |
| 符号与缩略语说明 | 第14-15页 |
| 前言 | 第15-16页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-22页 |
| 1 氯代硝基苯类化合物的污染 | 第16-17页 |
| 1.1 氯代硝基苯类化合物 | 第16页 |
| 1.2 氯代硝基苯类化合物的危害 | 第16-17页 |
| 2 微生物降解氯代硝基苯类化合物的降解机制研究 | 第17-20页 |
| 2.1 降解氯代硝基苯类化合物的微生物种类 | 第17-18页 |
| 2.2 降解氯代硝基苯类化合物的代谢途径及分子机制 | 第18-20页 |
| 3 氯代硝基苯类化合物微生物降解研究的意义 | 第20-22页 |
| 第二章 2,6-二氯-4-硝基酚降解菌株的分离鉴定与降解特性研究 | 第22-36页 |
| 第一节 2,6-二氯-4-硝基酚降解菌株的分离鉴定 | 第22-30页 |
| 1 材料与方法 | 第22-27页 |
| 1.1 培养基与试剂 | 第22-23页 |
| 1.2 DCNP的检测 | 第23页 |
| 1.3 DCNP降解菌株的分离 | 第23页 |
| 1.4 降解菌株的培养特征鉴定 | 第23页 |
| 1.5 降解菌株的16SrRNA基因序列的测定 | 第23-26页 |
| 1.5.1 菌体总DNA的提取 | 第23-24页 |
| 1.5.2 菌株16S rRNA基因的PCR扩增 | 第24-25页 |
| 1.5.4 一步法感受态细胞的制备与转化 | 第25-26页 |
| 1.5.5 质粒DNA的提取 | 第26页 |
| 1.5.6 16S rRNA基因序列测定 | 第26页 |
| 1.6 降解菌株22-1的抗生素敏感试验 | 第26-27页 |
| 2 结果与分析 | 第27-30页 |
| 2.1 DCNP降解菌株的富集与分离 | 第27-28页 |
| 2.2 降解菌株22-1对抗生素的敏感试验 | 第28页 |
| 2.3 降解菌株22-1的鉴定 | 第28-30页 |
| 第二节 降解菌株22-1对DCNP的降解特性研究 | 第30-35页 |
| 1 材料与方法 | 第30-32页 |
| 1.1 培养基与试剂 | 第30页 |
| 1.2 DCNP的检测 | 第30页 |
| 1.3 种子液培养和生长测定 | 第30页 |
| 1.4 菌株22-1对DCNP的降解特性研究 | 第30-32页 |
| 1.4.1 培养温度对菌株22-1降解DCNP的影响 | 第30页 |
| 1.4.2 pH值对菌株22-1降解DCNP的影响 | 第30-31页 |
| 1.4.3 接种量对菌株22-1降解DCNP的影响 | 第31页 |
| 1.4.4 DCNP的初始浓度对菌株22-1降解的影响 | 第31页 |
| 1.4.5 添加金属离子对菌株22-1降解DCNP的影响 | 第31页 |
| 1.4.6 菌株22-1对不同氯代硝基苯类化合物的降解研究 | 第31-32页 |
| 2 结果与分析 | 第32-35页 |
| 2.1 培养温度对对菌株22-1降解DCNP的影响 | 第32页 |
| 2.2 pH值对菌株22-1降解DCNP的影响 | 第32-33页 |
| 2.3 接种量对菌株22-1降解DCNP的影响 | 第33页 |
| 2.4 DCNP的初始浓度对菌株22-1降解的影响 | 第33-34页 |
| 2.5 添加金属离子对菌株22-1降解DCNP的影响 | 第34-35页 |
| 本章讨论 | 第35页 |
| 本章小结 | 第35-36页 |
| 第三章 菌株22-1的基因组测序、降解DCNP基因簇的预测及其功能验证 | 第36-56页 |
| 第一节 菌株22-1的基因组测序 | 第36-42页 |
| 1 材料与方法 | 第36-38页 |
| 1.1 菌株、培养基和试剂 | 第36页 |
| 1.1.1 菌株 | 第36页 |
| 1.1.2 培养基 | 第36页 |
| 1.1.3 试剂 | 第36页 |
| 1.2 菌株22-1基因组测序 | 第36-38页 |
| 1.2.1 Illumina MiSeq基因组测序实验 | 第36-38页 |
| 2 结果与分析 | 第38-42页 |
| 2.1 原始数据过滤、整理及质量评估 | 第38-39页 |
| 2.1.1 原始数据整理 | 第38-39页 |
| 2.2 基因组序列拼装与分析 | 第39-40页 |
| 2.3 功能元件分析 | 第40-42页 |
| 2.3.1 蛋白编码基因预测 | 第40-41页 |
| 2.3.2 非编码RNA预测 | 第41-42页 |
| 第二节 菌株22-1降解基因簇的预测及其功能验证 | 第42-54页 |
| 1 材料与方法 | 第42-50页 |
| 1.1 试剂与培养基 | 第42页 |
| 1.2 所用的菌株和引物 | 第42-43页 |
| 1.3 菌株基因组DNA的提取 | 第43-44页 |
| 1.4 DNA序列比较与分析 | 第44页 |
| 1.5 cnpA基因功能验证 | 第44-48页 |
| 1.5.1 同源臂的构建 | 第44-46页 |
| 1.5.2 同源重组载体的构建 | 第46-47页 |
| 1.5.3 三亲接合和同源重组突变菌株的筛选 | 第47页 |
| 1.5.4 突变株22-AcnpA降解特性研究 | 第47-48页 |
| 1.6 转录单元的鉴定 | 第48-50页 |
| 1.6.1 细菌总RNA的提取 | 第48-49页 |
| 1.6.2 反转录PCR | 第49页 |
| 1.6.3 反转录PCR产物的质量检测 | 第49页 |
| 1.6.4 转录单元cnpBADCE的确认 | 第49-50页 |
| 2 结果与分析 | 第50-54页 |
| 2.1 重叠延伸PCR扩增同源臂QcnpA | 第50页 |
| 2.2 同源重组载体的构建 | 第50-51页 |
| 2.3 同源重组突变菌株的筛选 | 第51页 |
| 2.4 细菌总RNA的提取 | 第51-52页 |
| 2.5 转录单元cnpBADCE的确认 | 第52-54页 |
| 本章讨论 | 第54页 |
| 本章小结 | 第54-56页 |
| 第四章 菌株22-1降解DCNP关键酶基因的克隆、表达、纯化和酶学特性研究 | 第56-70页 |
| 第一节 CnpA、CnpB的表达和纯化 | 第56-64页 |
| 1 材料与方法 | 第56-62页 |
| 1.1 试剂与培养基 | 第56页 |
| 1.2 菌株、质粒和引物 | 第56-57页 |
| 1.3 菌株基因组DNA的提取 | 第57页 |
| 1.4 感受态的制备及转化 | 第57页 |
| 1.4.1 大肠杆菌一步法感受态细胞的制备 | 第57页 |
| 1.4.2 酶切、酶连和转化 | 第57页 |
| 1.5 测序 | 第57页 |
| 1.6 cnpA和cnpB基因的PCR扩增 | 第57-58页 |
| 1.7 cnpA和cnpB表达载体的构建 | 第58-59页 |
| 1.8 重组菌株的低温诱导与高效表达 | 第59-60页 |
| 1.9 诱导蛋白的Ni-NTA亲和层析纯化 | 第60-61页 |
| 1.9.1 Ni-NTA树脂的再生 | 第60页 |
| 1.9.2 目的蛋白的纯化 | 第60-61页 |
| 1.10 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第61页 |
| 1.10.1 样品前处理 | 第61页 |
| 1.10.2 聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)的配制 | 第61页 |
| 1.10.3 SDS-PAGE电泳 | 第61-62页 |
| 1.10.4 染色和脱色 | 第62页 |
| 2 结果与分析 | 第62-64页 |
| 2.1 CnpA、CnpB的异源表达与纯化 | 第62-64页 |
| 2.1.1 PCR扩增cnpA、cnpB | 第62页 |
| 2.1.2 cnpA、cnpB表达载体的构建 | 第62-63页 |
| 2.1.3 CnpA、CnpB的表达和纯化 | 第63-64页 |
| 第二节 CnpAB酶学特性研究 | 第64-67页 |
| 1 材料与方法 | 第64-65页 |
| 1.1 培养基与试剂 | 第64页 |
| 1.2 酶的功能鉴定和酶学特性的分析 | 第64-65页 |
| 1.2.1 CnpAB活性的测定 | 第64页 |
| 1.2.2 CndAB最适反应温度 | 第64页 |
| 1.2.3 CnpAB最适反应pH | 第64页 |
| 1.2.4 金属离子对CnpAB活性的影响 | 第64-65页 |
| 2 结果与分析 | 第65-67页 |
| 2.1 CnpAB活性的测定 | 第65页 |
| 2.2 温度对CnpAB活性的影响 | 第65-66页 |
| 2.3 pH对CnpAB活性的影响 | 第66页 |
| 2.4 金属离子对CnpAB活性的影响 | 第66-67页 |
| 第三节 中间代谢产物的鉴定及代谢途径分析 | 第67-69页 |
| 1 材料与方法 | 第67-68页 |
| 1.1 培养基与试剂 | 第67页 |
| 1.2 菌株22-1降解DCNP代谢产物制备 | 第67页 |
| 1.3 代谢产物的质谱检测分析 | 第67-68页 |
| 1.4 菌株22-1降解DCNP代谢途径分析 | 第68页 |
| 2 结果与分析 | 第68-69页 |
| 2.1 代谢中间产物GC/MS分析 | 第68-69页 |
| 本章讨论 | 第69页 |
| 本章小结 | 第69-70页 |
| 参考文献 | 第70-76页 |
| 全文总结 | 第76-78页 |
| 硕士论文创新点 | 第78-80页 |
| 附录1 培养基和试剂配方 | 第80-84页 |
| 附录2 Ensifer sp. 22-1 16S rRNA序列 | 第84-86页 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 | 第86-88页 |
| 致谢 | 第88页 |
