| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 缩略语表 | 第12-13页 |
| 1、前言 | 第13-23页 |
| 1.1 线虫综述 | 第13-19页 |
| 1.1.1 秀丽隐杆线虫生物学特征 | 第13-14页 |
| 1.1.2 秀丽隐杆线虫解剖学特征 | 第14-16页 |
| 1.1.2.1 秀丽隐杆线虫的培养与保存 | 第16页 |
| 1.1.3 植物寄生线虫综述 | 第16-19页 |
| 1.1.3.1 植物寄生线虫的危害方式 | 第16-17页 |
| 1.1.3.2 植物寄生线虫的生活史 | 第17-18页 |
| 1.1.3.3 植物寄生线虫的生物防治 | 第18-19页 |
| 1.2 丁香假单胞菌毒力解析 | 第19-21页 |
| 1.2.1 RTX毒素简介 | 第20-21页 |
| 1.3 课题研究的目的和意义 | 第21-23页 |
| 2、材料与方法 | 第23-37页 |
| 2.1 实验材料与仪器 | 第23-30页 |
| 2.1.1 质粒和菌株 | 第23-25页 |
| 2.1.2 生测对象 | 第25-26页 |
| 2.1.3 实验试剂及配制 | 第26-29页 |
| 2.1.3.1 培养基 | 第26页 |
| 2.1.3.2 质粒抽提、感受态细胞制备与快检 | 第26-27页 |
| 2.1.3.3 PCR、酶切、酶连及琼脂糖凝胶电泳 | 第27页 |
| 2.1.3.4 外源蛋白的诱导与纯化 | 第27-28页 |
| 2.1.3.5 以秀丽隐杆线虫为试虫的生物活性测定试剂 | 第28-29页 |
| 2.1.4 基因中断所用试剂 | 第29页 |
| 2.1.5 主要仪器设备 | 第29-30页 |
| 2.2 实验方法 | 第30-37页 |
| 2.2.1 技术路线 | 第30页 |
| 2.2.2 分子操作 | 第30-32页 |
| 2.2.2.1 PCR扩增 | 第30-31页 |
| 2.2.2.2 蛋白浓度测定 | 第31-32页 |
| 2.2.3 秀丽隐杆线虫的饲养与同步化 | 第32页 |
| 2.2.3.1 秀丽隐杆线虫的饲养 | 第32页 |
| 2.2.3.2 秀丽隐杆线虫的裂解与同步化 | 第32页 |
| 2.2.4 以秀丽隐杆线虫为试虫的生物活性测定 | 第32-33页 |
| 2.2.4.1 纯化蛋白生测试验中LC_(50)值和LT_(50)值的测定 | 第32-33页 |
| 2.2.4.2 L1期线虫生长抑制试验 | 第33页 |
| 2.2.4.3 影响线虫产卵率实验 | 第33页 |
| 2.2.5 线虫病理观察 | 第33-34页 |
| 2.2.6 以南方根结线虫为试虫的生物活性测定 | 第34页 |
| 2.2.7 基因中断 | 第34-35页 |
| 2.2.8 实时荧光定量PCR | 第35-37页 |
| 2.2.8.1 线虫总RNA提取和反转录 | 第35-36页 |
| 2.2.8.2 反转录体系(10μL) | 第36-37页 |
| 3、结果与分析 | 第37-60页 |
| 3.1 丁香假单胞菌MB03中杀线虫毒性基因的筛选 | 第37-38页 |
| 3.2 PTXA保守结构域及生物信息学分析 | 第38页 |
| 3.3 目的基因的原核表达 | 第38-43页 |
| 3.3.1 目的基因的表达载体构建 | 第38-40页 |
| 3.3.2 重组菌的诱导表达 | 第40-41页 |
| 3.3.3 外源蛋白的亲和层析纯化 | 第41-42页 |
| 3.3.4 目的蛋白的western-blotting检测 | 第42-43页 |
| 3.4 纯化蛋白对秀丽隐杆线虫的生测实验 | 第43-50页 |
| 3.4.1 对线虫LC_(50)的测定 | 第43-44页 |
| 3.4.2 对L1期线虫生长的影响 | 第44-46页 |
| 3.4.3 PtxA纯化蛋白对秀丽线虫产卵率的影响 | 第46页 |
| 3.4.4 重组菌对线虫取食偏好性的影响 | 第46-47页 |
| 3.4.5 PtxA纯化蛋白对南方根结线虫的LC_(50)测定 | 第47-49页 |
| 3.4.6 线虫肠道病理观察 | 第49-50页 |
| 3.5 PTXA两个结构域的杀虫毒性比较 | 第50-53页 |
| 3.5.1 截断结构域基因的表达载体构建 | 第50-51页 |
| 3.5.2 重组菌的诱导表达和亲和纯化 | 第51-52页 |
| 3.5.3 DUF和M10_C纯化蛋白对秀丽隐杆线虫的毒性测定 | 第52-53页 |
| 3.6 毒性基因中断及其对MB03毒性的影响 | 第53-57页 |
| 3.6.1 ptxA基因的中断 | 第53-55页 |
| 3.6.2 野生菌株MB03和中断菌株ΔPtxA的毒性比较 | 第55-57页 |
| 3.7 PTXA对秀丽隐杆线虫中4个受体基因表达量的影响 | 第57-60页 |
| 3.7.1 rps9、rps25、col-77、daf-21 PCR结果 | 第58页 |
| 3.7.2 rps9、rps25、col77、daf-21实时定量PCR结果 | 第58-60页 |
| 4、总结与讨论 | 第60-65页 |
| 4.1 总结 | 第60-61页 |
| 4.2 讨论 | 第61-63页 |
| 4.3 不足与展望 | 第63-65页 |
| 参考文献 | 第65-72页 |
| 致谢 | 第72页 |
