| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-31页 |
| 1.1 三七中的化学成分 | 第16-18页 |
| 1.1.1 皂苷成分 | 第16-17页 |
| 1.1.2 甾醇 | 第17页 |
| 1.1.3 三七素 | 第17页 |
| 1.1.4 黄酮类 | 第17页 |
| 1.1.5 糖类 | 第17-18页 |
| 1.1.6 氨基酸成分 | 第18页 |
| 1.1.7 挥发油成分 | 第18页 |
| 1.1.8 无机及微量元素 | 第18页 |
| 1.2 三七药理学研究进展 | 第18-22页 |
| 1.2.1 对血液系统的影响 | 第19页 |
| 1.2.1.1 止血功效 | 第19页 |
| 1.2.1.2 活血化瘀以及抗血栓功效 | 第19页 |
| 1.2.2 对心脑血管系统的影响 | 第19-20页 |
| 1.2.2.1 抗心肌缺血 | 第19页 |
| 1.2.2.2 抗心律失常 | 第19-20页 |
| 1.2.2.3 降血压 | 第20页 |
| 1.2.2.4 防止动脉粥样硬化 | 第20页 |
| 1.2.2.5 保护脑组织 | 第20页 |
| 1.2.3 保肝作用 | 第20页 |
| 1.2.4 抗炎作用 | 第20-21页 |
| 1.2.5 抗癌作用 | 第21页 |
| 1.2.6 延缓衰老及调节免疫作用 | 第21页 |
| 1.2.7 其它作用 | 第21-22页 |
| 1.3 三七皂苷的生物合成途径 | 第22-24页 |
| 1.4 三七皂苷生物合成途径中的关键酶 | 第24-26页 |
| 1.4.1 法呢基焦磷酸合酶 | 第24页 |
| 1.4.2 鲨烯合酶 | 第24-25页 |
| 1.4.3 鲨烯环氧酶 | 第25页 |
| 1.4.4 达玛烯二醇合酶和环阿屯醇合酶 | 第25-26页 |
| 1.5 组合生物合成技术及其应用 | 第26-28页 |
| 1.5.1 组合生物合成技术简介 | 第26页 |
| 1.5.2 聚酮类化合物的组合生物合成 | 第26-27页 |
| 1.5.3 萜类化合物的组合生物合成 | 第27-28页 |
| 1.5.3.1 青蒿素的组合生物合成 | 第27-28页 |
| 1.5.3.2 紫杉醇的组合生物合成 | 第28页 |
| 1.5.3.3 三萜皂苷的组合生物合成 | 第28页 |
| 1.6 本研究的目的及意义 | 第28-30页 |
| 1.7 实验技术路线 | 第30-31页 |
| 第二章 三七细胞中FPS基因的克隆及其过表达载体的构建 | 第31-48页 |
| 2.1 前言 | 第31页 |
| 2.2 材料与试剂 | 第31-33页 |
| 2.2.1 植物材料 | 第31页 |
| 2.2.2 质粒和菌种 | 第31页 |
| 2.2.3 试剂 | 第31-32页 |
| 2.2.4 各种缓冲液、培养基和抗生素母液的配制 | 第32-33页 |
| 2.3 实验方法 | 第33-40页 |
| 2.3.1 三七细胞中总RNA的提取及纯化 | 第33-34页 |
| 2.3.2 FPS基因的克隆 | 第34-37页 |
| 2.3.2.1 cDNA的合成 | 第34页 |
| 2.3.2.2 FPS基因的PCR扩增 | 第34-35页 |
| 2.3.2.3 PCR产物的胶回收 | 第35-36页 |
| 2.3.2.4 T-A克隆 | 第36页 |
| 2.3.2.5 连接产物转化Trans1-T1感受态细胞 | 第36-37页 |
| 2.3.3 pCAMBIA1300S-FPS过表达载体的构建 | 第37-40页 |
| 2.3.3.1 pCAMBIA1300S和pGEM-FPS质粒的提取 | 第37-38页 |
| 2.3.3.2 pCAMBIA1300S和pGEM-FPS质粒的双酶切 | 第38页 |
| 2.3.3.3 pCAMBIA1300S和pGEM-FPS质粒双酶切产物的胶回收 | 第38-39页 |
| 2.3.3.4 连接反应 | 第39页 |
| 2.3.3.5 连接产物转化Trans1-T1感受态细胞 | 第39-40页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第40-46页 |
| 2.4.1 三七细胞中总RNA的提取 | 第40-41页 |
| 2.4.2 FPS基因的克隆 | 第41-42页 |
| 2.4.3 pCAMBIA1300S和pGEM-FPS质粒的提取和双酶切 | 第42-44页 |
| 2.4.4 pCAMBIA1300S和pGEM-FPS质粒双酶切产物的胶回收 | 第44-45页 |
| 2.4.5 pCAMBIA1300S-FPS重组质粒的构建 | 第45-46页 |
| 2.5 小结 | 第46-48页 |
| 第三章 根瘤农杆菌介导的遗传转化及转基因细胞的筛选 | 第48-67页 |
| 3.1 前言 | 第48-49页 |
| 3.2 材料与试剂 | 第49-50页 |
| 3.2.1 植物材料 | 第49页 |
| 3.2.2 菌种 | 第49页 |
| 3.2.3 试剂 | 第49页 |
| 3.2.4 各种缓冲液、培养基和抗生素母液的配制 | 第49-50页 |
| 3.3 实验方法 | 第50-57页 |
| 3.3.1 pCAMBIA1300S-FPS质粒的提取 | 第50页 |
| 3.3.2 EHA105感受态细胞的制备 | 第50-51页 |
| 3.3.3 pCAMBIA1300S-FPS质粒转化EHA105感受态细胞 | 第51页 |
| 3.3.4 转pCAMBIA1300S-FPS农杆菌菌液PCR检测 | 第51-52页 |
| 3.3.5 阳性农杆菌的活化 | 第52页 |
| 3.3.6 农杆菌介导的三七遗传转化 | 第52-53页 |
| 3.3.7 CTAB提取转基因三七细胞中的基因组DNA | 第53-54页 |
| 3.3.8 转基因三七细胞的基因组PCR检测 | 第54-55页 |
| 3.3.9 三七细胞中FPS、CAS基因在不同生长阶段的表达分析 | 第55-56页 |
| 3.3.10 转基因三七细胞中FPS、CAS基因的表达分析 | 第56-57页 |
| 3.3.10.1 FPS、CAS基因的RT-PCR表达分析 | 第56页 |
| 3.3.10.2 FPS、CAS基因的qRT-PCR表达分析 | 第56-57页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第57-65页 |
| 3.4.1 转pCAMBIA1300S-FPS EHA105农杆菌的鉴定 | 第57-58页 |
| 3.4.2 农杆菌介导的三七遗传转化 | 第58-59页 |
| 3.4.2.1 乙酰丁香酮在农杆菌转化三七细胞过程中的作用 | 第58页 |
| 3.4.2.2 农杆菌的抑制问题 | 第58-59页 |
| 3.4.3 转基因三七细胞系的基因组PCR检测 | 第59-60页 |
| 3.4.4 三七细胞中FPS、CAS在不同生长时期的表达分析 | 第60-61页 |
| 3.4.5 转基因阳性细胞中FPS和CAS基因的表达分析 | 第61-65页 |
| 3.4.5.1 FPS和CAS基因的RT-PCR表达分析 | 第62-63页 |
| 3.4.5.2 FPS和CAS基因的qRT-PCR表达分析 | 第63-65页 |
| 3.5 小结 | 第65-67页 |
| 第四章 转基因三七细胞中皂苷及植物甾醇含量的测定 | 第67-79页 |
| 4.1 前言 | 第67页 |
| 4.2 材料、试剂与仪器 | 第67-68页 |
| 4.2.1 植物材料 | 第67页 |
| 4.2.2 试剂与仪器 | 第67-68页 |
| 4.3 实验方法 | 第68-72页 |
| 4.3.1 转基因三七细胞中总皂苷含量的测定 | 第68-70页 |
| 4.3.1.1 三七总皂苷标准曲线的绘制 | 第68-69页 |
| 4.3.1.2 转基因三七细胞中总皂苷含量的测定 | 第69-70页 |
| 4.3.2 转基因三七细胞中部分重要单体皂苷含量的测定 | 第70-71页 |
| 4.3.3 转基因三七细胞中总植物甾醇含量的测定 | 第71-72页 |
| 4.3.3.1 植物甾醇标准曲线的绘制 | 第71页 |
| 4.3.3.2 总植物甾醇含量的测定 | 第71-72页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第72-77页 |
| 4.4.1 三七总皂苷含量的测定 | 第72-74页 |
| 4.4.1.1 三七总皂苷标准曲线的绘制 | 第72-73页 |
| 4.4.1.2 转基因三七细胞中总皂苷含量的测定 | 第73-74页 |
| 4.4.2 转基因三七细胞中部分重要单体皂苷含量的测定 | 第74-76页 |
| 4.4.3 转基因三七细胞中总植物甾醇含量的测定 | 第76-77页 |
| 4.4.3.1 植物甾醇标准曲线的绘制 | 第76页 |
| 4.4.3.2 总植物甾醇含量的测定 | 第76-77页 |
| 4.5 小结 | 第77-79页 |
| 第五章 结论与展望 | 第79-82页 |
| 5.1 结论 | 第79-80页 |
| 5.2 展望 | 第80-82页 |
| 参考文献 | 第82-90页 |
| 致谢 | 第90-91页 |
| 附录 攻读硕士期间发表文章目录 | 第91页 |
