| 英文缩略词 | 第4-9页 |
| 中文摘要 | 第9-10页 |
| ABSTRACT | 第10-11页 |
| 1 文献综述 | 第12-21页 |
| 1.1 病原学综述 | 第12-13页 |
| 1.1.1 结核分枝杆菌的分类 | 第12页 |
| 1.1.2 结核分枝杆菌的生物学特性 | 第12-13页 |
| 1.1.3 结核分枝杆菌的基因组特点 | 第13页 |
| 1.2 牛结核病综述 | 第13-16页 |
| 1.2.1 牛结核病的流行现状 | 第13-14页 |
| 1.2.2 牛结核病的危害 | 第14-15页 |
| 1.2.3 牛结核病的发病及免疫机理 | 第15-16页 |
| 1.3 牛结核病诊断技术综述 | 第16-18页 |
| 1.3.1 细菌学检查方法 | 第16页 |
| 1.3.2 免疫学检测方法 | 第16-17页 |
| 1.3.3 分子生物学诊断技术 | 第17-18页 |
| 1.4 ESAT6 与 CFP10 抗原综述 | 第18-20页 |
| 1.4.1 ESAT6 抗原与 CFP10 抗原的发现 | 第18页 |
| 1.4.2 ESAT6 抗原与 CFP10 抗原的特质 | 第18-19页 |
| 1.4.3 ESAT6 与 CFP10 作为诊断抗原的研究进展 | 第19-20页 |
| 1.5 研究的目的与意义 | 第20-21页 |
| 2 材料与方法 | 第21-32页 |
| 2.1 材料 | 第21-22页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第21页 |
| 2.1.2 主要仪器及试剂 | 第21-22页 |
| 2.1.3 试验动物与细胞 | 第22页 |
| 2.2 方法 | 第22-32页 |
| 2.2.1 牛结核分枝杆菌 ESAT6/CFP10 融合基因的 PCR 扩增 | 第22-23页 |
| 2.2.2 原核表达载体 pET-32a（+）-ESAT6/CFP10 的构建及鉴定 | 第23-24页 |
| 2.2.3 真核表达载体 pEGFP-N1-ESAT6/CFP10 的构建及鉴定 | 第24-25页 |
| 2.2.4 负载 pEGFP-N1-ESAT6/CFP10 基因的巨噬细胞的制备 | 第25-26页 |
| 2.2.5 重组细菌的诱导表达及其产物的鉴定 | 第26页 |
| 2.2.6 重组蛋白的 Western blot 分析 | 第26-27页 |
| 2.2.7 重组蛋白的纯化 | 第27-29页 |
| 2.2.8 注射试剂的稀释 | 第29页 |
| 2.2.9 牛结核病皮肤变态反应试验 | 第29-30页 |
| 2.2.10 牛结核病 IFN-γ释放试验 | 第30-31页 |
| 2.2.11 融合蛋白 ESAT6/CFP10 对 NR8383 增殖影响的测定 | 第31页 |
| 2.2.12 融合蛋白 ESAT6/CFP10 对 NR8383 生成 NO 能力影响的测定 | 第31页 |
| 2.2.13 数据分析与处理 | 第31-32页 |
| 3 结果与分析 | 第32-48页 |
| 3.1 融合基因的 PCR 扩增结果 | 第32-33页 |
| 3.2 重组原核质粒 pET-32a（+）-ESAT6/CFP10 的鉴定 | 第33-34页 |
| 3.2.1 pET32a（+）-ESAT6/CFP10 的双酶切鉴定 | 第33页 |
| 3.2.2 pET32a（+）-ESAT6/CFP10 的测序结果 | 第33-34页 |
| 3.3 重组真核质粒 pEGFP-N1-ESAT6/CFP10 的构建及鉴定 | 第34-35页 |
| 3.3.1 重组质粒的双酶切鉴定 | 第34-35页 |
| 3.3.2 重组质粒的测序鉴定 | 第35页 |
| 3.4 转染试验及转染阳性 NR8383 巨噬细胞的检测结果 | 第35-36页 |
| 3.5 ESAT6/CFP10 蛋白在大肠杆菌 BL21（DE3）中的表达鉴定 | 第36-38页 |
| 3.5.1 重组菌优化表达的结果 | 第36-37页 |
| 3.5.2 重组菌表达形式的分析结果 | 第37-38页 |
| 3.6 重组蛋白 ESAT6/CFP10 的 Western blot 验证结果 | 第38页 |
| 3.7 重组蛋白 ESAT6/CFP10 的纯化结果 | 第38-39页 |
| 3.8 纯化重组蛋白的浓度及纯度测定 | 第39页 |
| 3.9 皮肤变态反应试验的结果 | 第39-43页 |
| 3.9.1 牛型 PPD 变态反应的结果 | 第39-41页 |
| 3.9.2 重组融合蛋白变态反应的结果 | 第41-43页 |
| 3.10 牛结核病 IFN-γ释放试验的结果 | 第43-45页 |
| 3.11 融合蛋白 ESAT6/CFP10 对 NR8383 生长影响的测定 | 第45-46页 |
| 3.11.1 ESAT6/CFP10 对未负载细胞增殖影响的结果 | 第45-46页 |
| 3.11.2 ESAT6-CFP10 对负载细胞增殖影响的结果 | 第46页 |
| 3.12 融合蛋白 ESAT6/CFP10 对 NR8383 生成 NO 能力影响的测定 | 第46-48页 |
| 4 讨论 | 第48-52页 |
| 4.1 目的基因的选取 | 第48页 |
| 4.2 融合基因的构建 | 第48-49页 |
| 4.3 原核表达载体的选择 | 第49页 |
| 4.4 真核表达载体的选择 | 第49页 |
| 4.5 纯化介质的选择 | 第49-50页 |
| 4.6 融合蛋白在皮试中的敏感性与特异性 | 第50页 |
| 4.7 重组蛋白在 IFN-γ ELISA 试验中的表现 | 第50页 |
| 4.8 重组蛋白在细胞试验中的潜在作用 | 第50-51页 |
| 4.9 试验中可能存在的问题 | 第51-52页 |
| 4.9.1 PPD 试验中的测量时间 | 第51页 |
| 4.9.2 病原的分离培养 | 第51-52页 |
| 参考文献 | 第52-59页 |
| 附录：常规试剂与培养基的配制 | 第59-62页 |
| 致谢 | 第62页 |
