| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 第1章 文献综述 | 第11-21页 |
| 1.1 米曲霉中性蛋白酶 | 第11-13页 |
| 1.1.1 米曲霉简介 | 第11页 |
| 1.1.2 中性蛋白酶 | 第11-13页 |
| 1.2 重组中性蛋白酶的表达 | 第13-16页 |
| 1.2.1 毕赤酵母表达系统 | 第13-14页 |
| 1.2.2 重组蛋白质的糖基化研究 | 第14-16页 |
| 1.3 提高中性蛋白酶热稳定性的分子改造 | 第16-21页 |
| 1.3.1 酶的热稳定性的概念 | 第16-17页 |
| 1.3.2 提高酶热稳定性的策略 | 第17-21页 |
| 第2章 重组中性蛋白酶在毕赤酵母中的表达、纯化及性质分析 | 第21-42页 |
| 2.1 引言 | 第21-22页 |
| 2.2 材料 | 第22-24页 |
| 2.2.1 菌种和质粒 | 第22页 |
| 2.2.2 主要仪器与设备 | 第22页 |
| 2.2.3 生化试剂 | 第22-23页 |
| 2.2.4 主要溶液和培养基 | 第23-24页 |
| 2.3 方法 | 第24-31页 |
| 2.3.1 引物设计 | 第24页 |
| 2.3.2 表达载体 pPIC9K-NPI-6His 的构建 | 第24-26页 |
| 2.3.3 表达载体 pPIC9K-NPI-6His 的转化与鉴定 | 第26-28页 |
| 2.3.4 重组中性蛋白酶的摇瓶诱导表达 | 第28-29页 |
| 2.3.5 重组中性蛋白酶的纯化分析 | 第29-30页 |
| 2.3.6 重组中性蛋白酶的酶学性质分析 | 第30-31页 |
| 2.4 结果与分析 | 第31-40页 |
| 2.4.1 表达载体 pPIC9K-NPI-6His 的构建结果 | 第31-32页 |
| 2.4.2 酵母重组子的表型鉴定 | 第32-33页 |
| 2.4.3 重组中性蛋白酶的诱导表达 | 第33-34页 |
| 2.4.4 重组中性蛋白酶的纯化 | 第34-36页 |
| 2.4.5 重组中性蛋白酶酶学性质分析 | 第36-40页 |
| 2.5 讨论 | 第40-41页 |
| 2.5.1 毕赤酵母表型鉴定 | 第40页 |
| 2.5.2 重组中性蛋白酶的性质分析 | 第40-41页 |
| 2.6 小结 | 第41-42页 |
| 第3章 重组中性蛋白酶的糖基化分析 | 第42-55页 |
| 3.1 引言 | 第42页 |
| 3.2 材料 | 第42-43页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第42页 |
| 3.2.2 主要仪器与设备 | 第42-43页 |
| 3.2.3 生化试剂 | 第43页 |
| 3.2.4 主要溶液和培养基 | 第43页 |
| 3.3 方法 | 第43-47页 |
| 3.3.1 电泳凝胶的糖蛋白染色 | 第43-44页 |
| 3.3.2 重组中性蛋白酶的去糖基化处理 | 第44页 |
| 3.3.3 蛋白分子量的质谱鉴定 | 第44页 |
| 3.3.4 重组中性蛋白酶的糖基化位点鉴定 | 第44-45页 |
| 3.3.5 rNPI 蛋白三维模型的构建 | 第45页 |
| 3.3.6 定点突变表达载体 pPIC9K-NPI-N41A-6His 的构建 | 第45-47页 |
| 3.3.7 N41A 突变株的构建与表达 | 第47页 |
| 3.4 结果与分析 | 第47-52页 |
| 3.4.1 rNPI 蛋白糖基化现象的确定 | 第47-48页 |
| 3.4.2 rNPI 蛋白糖基化程度分析 | 第48页 |
| 3.4.3 重组 NPI 糖基化位点的鉴定 | 第48-50页 |
| 3.4.4 NPI 蛋白三维结构的模拟 | 第50-51页 |
| 3.4.5 N41A 的定点突变结果 | 第51-52页 |
| 3.5 讨论 | 第52-54页 |
| 3.5.1 重组中性蛋白酶的 N-糖基化 | 第52-53页 |
| 3.5.2 糖基化作用对重组蛋白酶性质的影响 | 第53-54页 |
| 3.6 小结 | 第54-55页 |
| 第4章 提高重组中性蛋白酶热稳定性的定向进化 | 第55-68页 |
| 4.1 引言 | 第55页 |
| 4.2 材料 | 第55-56页 |
| 4.2.1 菌种和质粒 | 第55页 |
| 4.2.2 主要仪器与设备 | 第55页 |
| 4.2.3 生化试剂 | 第55-56页 |
| 4.2.4 主要溶液和培养基 | 第56页 |
| 4.3 方法 | 第56-60页 |
| 4.3.1 NPI 的随机突变 | 第56页 |
| 4.3.2 NPI 随机突变大肠杆菌文库的构建 | 第56-57页 |
| 4.3.3 NPI 随机突变毕赤酵母文库的构建 | 第57-59页 |
| 4.3.4 热稳定性提高突变子的筛选 | 第59页 |
| 4.3.5 热稳定性提高突变体酶的验证 | 第59-60页 |
| 4.3.6 突变体酶三维模型的构建 | 第60页 |
| 4.4 结果与分析 | 第60-66页 |
| 4.4.1 NPI 的随机突变 | 第60页 |
| 4.4.2 NPI 随机突变文库的构建和鉴定 | 第60-62页 |
| 4.4.3 热稳定性突变体酶的筛选 | 第62页 |
| 4.4.4 热稳定性提高突变体酶 3D30 的验证 | 第62-64页 |
| 4.4.5 突变体酶三维结构的模拟 | 第64-66页 |
| 4.5 讨论 | 第66-67页 |
| 4.5.1 NPI 随机突变库的构建及筛选 | 第66页 |
| 4.5.2 S93A 突变体酶的三维结构分析 | 第66-67页 |
| 4.6 小结 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-74页 |
| 致谢 | 第74-75页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第75页 |
