| 摘要 | 第6-8页 |
| abstract | 第8-10页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-32页 |
| 1.1 农药创制 | 第16-19页 |
| 1.1.1 新形势下对农药研发的要求 | 第16页 |
| 1.1.2 农药创制的研究现状 | 第16-18页 |
| 1.1.3 农药创制新趋势 | 第18-19页 |
| 1.2 杀虫剂作用靶标的研究现状 | 第19-24页 |
| 1.2.1 神经系统 | 第19-21页 |
| 1.2.2 呼吸系统 | 第21-22页 |
| 1.2.3 生长发育系统 | 第22页 |
| 1.2.4 肌肉系统 | 第22-23页 |
| 1.2.5 消化系统 | 第23-24页 |
| 1.2.6 其它 | 第24页 |
| 1.3 杠柳作用机理研究进展 | 第24-29页 |
| 1.3.1 杠柳简介 | 第24-26页 |
| 1.3.2 症状学及组织病理学研究 | 第26-27页 |
| 1.3.3 昆虫中肠消化酶系酶活的研究 | 第27页 |
| 1.3.4 靶蛋白定位研究 | 第27-28页 |
| 1.3.5 靶蛋白分离研究 | 第28页 |
| 1.3.6 电生理研究 | 第28-29页 |
| 1.4 论文设计思路 | 第29-32页 |
| 1.4.1 选题背景、目的及意义 | 第29-30页 |
| 1.4.2 研究内容 | 第30-31页 |
| 1.4.3 研究技术路线 | 第31-32页 |
| 第二章 杠柳新苷P对粘虫中肠细胞BBMV的2-DE分析 | 第32-47页 |
| 2.1 材料 | 第33-34页 |
| 2.1.1 供试昆虫 | 第33页 |
| 2.1.2 供试化合物与试剂 | 第33页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第33-34页 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 | 第34页 |
| 2.2 方法 | 第34-38页 |
| 2.2.1 试虫处理 | 第34页 |
| 2.2.2 BBMV的制备 | 第34-36页 |
| 2.2.3 双向凝胶电泳 | 第36-38页 |
| 2.2.4 数据统计分析 | 第38页 |
| 2.3 结果分析 | 第38-43页 |
| 2.3.1 粘虫中肠细胞BBMV提取纯度的检测 | 第38-39页 |
| 2.3.2 双向电泳图谱分析及差异蛋白点质谱鉴定 | 第39-42页 |
| 2.3.3 蛋白功能生物信息学分析 | 第42-43页 |
| 2.4 讨论 | 第43-46页 |
| 2.5 本章小结 | 第46-47页 |
| 第三章 杠柳新苷类化合物对粘虫中肠细胞BBMV中三种特征酶活性的影响 | 第47-61页 |
| 3.1 材料 | 第47-50页 |
| 3.1.1 供试昆虫 | 第47-48页 |
| 3.1.2 供试化合物 | 第48页 |
| 3.1.3 供试试剂 | 第48-49页 |
| 3.1.4 主要仪器 | 第49页 |
| 3.1.5 缓冲液的配制 | 第49-50页 |
| 3.2 方法 | 第50-53页 |
| 3.2.1 杠柳新苷类化合物的杀虫活性 | 第50页 |
| 3.2.2 东方粘虫中肠细胞BBMV的制备和检测 | 第50-51页 |
| 3.2.3 蛋白含量标准测定方法 | 第51页 |
| 3.2.4 杠柳新苷类化合物对氨肽酶N的活性测定 | 第51页 |
| 3.2.5 杠柳新苷类化合物对碱性磷酸酶的活性测定 | 第51页 |
| 3.2.6 杠柳新苷类化合物对V-ATPase的活性测定 | 第51-52页 |
| 3.2.7 数据统计分析 | 第52-53页 |
| 3.3 结果与分析 | 第53-57页 |
| 3.3.1 杠柳新苷类化合物的杀虫活性 | 第53页 |
| 3.3.2 杠柳新苷类化合物对氨肽酶活性的影响 | 第53-55页 |
| 3.3.3 杠柳新苷类化合物对碱性磷酸酶活性的影响 | 第55-56页 |
| 3.3.4 杠柳新苷类化合物对V-ATPase活性的影响 | 第56-57页 |
| 3.4 讨论 | 第57-60页 |
| 3.5 本章小结 | 第60-61页 |
| 第四章 东方粘虫幼虫中肠V-ATPaseA亚基真核表达系统的构建及与杠柳新苷类化合物的结合亲和性研究 | 第61-84页 |
| 4.1 材料 | 第62-64页 |
| 4.1.1 供试昆虫 | 第62页 |
| 4.1.2 供试化合物 | 第62页 |
| 4.1.3 供试试剂 | 第62-63页 |
| 4.1.4 主要仪器 | 第63页 |
| 4.1.5 主要试剂的配置 | 第63-64页 |
| 4.2 方法 | 第64-69页 |
| 4.2.1 昆虫细胞培养 | 第64-65页 |
| 4.2.2 粘虫V-ATPaseA亚基全长cDNA的克隆 | 第65-68页 |
| 4.2.3 荧光猝灭光谱法测定野生型蛋白与杠柳新苷类化合物的体外结合能力 | 第68-69页 |
| 4.2.4 等温滴定量热法(ITC)测定突变体蛋白与杠柳新苷类化合物的体外结合能力 | 第69页 |
| 4.3 结果与分析 | 第69-81页 |
| 4.3.1 东方粘虫幼虫中肠总RNA的提取 | 第69-70页 |
| 4.3.2 东方粘虫幼虫中肠VatpA的PCR扩增 | 第70页 |
| 4.3.3 东方粘虫幼虫中肠VatpA的PCR产物回收 | 第70-71页 |
| 4.3.4 东方粘虫幼虫中肠VatpA基因的TA克隆 | 第71页 |
| 4.3.5 东方粘虫VatpA基因的双酶切制备 | 第71-72页 |
| 4.3.6 真核表达载体pBacPAK9的双酶切制备 | 第72页 |
| 4.3.7 重组杆状病毒表达载体质粒pBacPAK9/VatpA的构建 | 第72-73页 |
| 4.3.8 重组杆状病毒表达载体质粒pBacPAK9/VatpA的转染 | 第73页 |
| 4.3.9 东方粘虫幼虫中肠VatpaseA亚基的侵染表达 | 第73-74页 |
| 4.3.10 东方粘虫幼虫中肠VatpaseA亚基表达蛋白的纯化 | 第74页 |
| 4.3.11 pH值对重组蛋白的结合能力的影响 | 第74-75页 |
| 4.3.12 荧光光谱法测定野生型重组蛋白与杠柳新苷类化合物的结合能力 | 第75-78页 |
| 4.3.13 ITC方法测定野生型重组蛋白与杠柳新苷类化合物的结合能力 | 第78-81页 |
| 4.4 讨论 | 第81-83页 |
| 4.5 本章小结 | 第83-84页 |
| 第五章 东方粘虫幼虫中肠V-ATPaseA亚基同源建模及与杠柳新苷类化合物的柔性分子对接 | 第84-107页 |
| 5.1 材料 | 第85-86页 |
| 5.2 方法 | 第86-88页 |
| 5.2.1 东方粘虫幼虫中肠V-ATPaseA亚基同源模型的构建及评估 | 第86-87页 |
| 5.2.2 东方粘虫幼虫中肠V-ATPaseA亚基模型上活性腔的确定 | 第87页 |
| 5.2.3 杠柳新苷类化合物3D结构的构建及优化 | 第87页 |
| 5.2.4 分子对接 | 第87-88页 |
| 5.3 结果与分析 | 第88-104页 |
| 5.3.1 模板蛋白序列的搜索 | 第88页 |
| 5.3.2 目的蛋白序列(粘虫V-ATPaseA亚基)与模板蛋白序列的比对 | 第88-89页 |
| 5.3.3 3D模型的构建 | 第89-90页 |
| 5.3.4 模型评估 | 第90-93页 |
| 5.3.5 活性腔的确定 | 第93-95页 |
| 5.3.6 杠柳新苷类化合物与V-ATPaseA亚基三维结构模型的柔性分子对接 | 第95-102页 |
| 5.3.7 杠柳新苷类化合物与V-ATPaseA亚基模型对接结果的打分函数评价 | 第102-103页 |
| 5.3.8 杠柳新苷类化合物与野生型重组蛋白之间结合常数与对接分值的相关性 | 第103-104页 |
| 5.4 讨论 | 第104-106页 |
| 5.5 本章小结 | 第106-107页 |
| 第六章 东方粘虫幼虫中肠V-ATPaseA亚基的定点突变及与活性化合物杠柳新苷P和T的亲和性研究 | 第107-130页 |
| 6.1 材料 | 第108-109页 |
| 6.1.1 供试化合物 | 第108页 |
| 6.1.2 供试试剂 | 第108页 |
| 6.1.3 主要仪器 | 第108-109页 |
| 6.2 方法 | 第109-113页 |
| 6.2.1 定点突变基因的引物设计 | 第109-110页 |
| 6.2.2 突变体基因的PCR扩增 | 第110-111页 |
| 6.2.3 连接和转化 | 第111页 |
| 6.2.4 突变体的真核表达与蛋白纯化 | 第111-112页 |
| 6.2.5 荧光猝灭光谱法测定突变蛋白与杠柳新苷类活性化合物的结合能力 | 第112页 |
| 6.2.6 等温滴定量热法(ITC)测定突变体蛋白与杠柳新苷类活性化合物的结合能力 | 第112-113页 |
| 6.2.7 杠柳新苷类活性化合物作用模型的优化和建立 | 第113页 |
| 6.3 结果与分析 | 第113-127页 |
| 6.3.1 突变基因的克隆 | 第113-115页 |
| 6.3.2 突变体的真核表达及蛋白纯化 | 第115-117页 |
| 6.3.3 荧光猝灭光谱法测定突变型重组蛋白与杠柳新苷P和T的结合能力 | 第117-120页 |
| 6.3.4 ITC方法测定突变型重组蛋白与杠柳新苷P和T的结合能力 | 第120-126页 |
| 6.3.5 杠柳新苷类活性化合物作用模型的建立 | 第126-127页 |
| 6.4 讨论 | 第127-129页 |
| 6.5 本章小结 | 第129-130页 |
| 第七章 讨论与结论 | 第130-136页 |
| 7.1 讨论 | 第130-133页 |
| 7.1.1 V型ATP酶(V-ATPase)作为杀虫剂新靶标的可能性 | 第130-131页 |
| 7.1.2 杠柳新苷类杀虫活性化合物的作用机理 | 第131-133页 |
| 7.2 结论 | 第133-134页 |
| 7.3 本研究的主要创新点 | 第134页 |
| 7.4 亟待进一步研究的问题 | 第134-136页 |
| 参考文献 | 第136-151页 |
| 致谢 | 第151-152页 |
| 作者简介 | 第152页 |
