| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 1 文献综述 | 第16-46页 |
| 1.1 生物技术药物 | 第16-21页 |
| 1.1.1 生物技术药物的定义 | 第16页 |
| 1.1.2 生物技术药物的发展概况 | 第16-19页 |
| 1.1.3 重组蛋白表达系统 | 第19-21页 |
| 1.2 分子修饰技术 | 第21页 |
| 1.3 蛋白质的聚乙二醇修饰 | 第21-32页 |
| 1.3.1 蛋白质的聚乙二醇修饰简介 | 第21-22页 |
| 1.3.2 聚乙二醇简介 | 第22页 |
| 1.3.3 聚乙二醇修饰技术优势 | 第22-24页 |
| 1.3.3.1 免疫原性 | 第23页 |
| 1.3.3.2 循环半衰期 | 第23页 |
| 1.3.3.3 稳定性 | 第23-24页 |
| 1.3.3.4 溶解性 | 第24页 |
| 1.3.3.5 活性 | 第24页 |
| 1.3.4 聚乙二醇修饰药物现状 | 第24-25页 |
| 1.3.5 聚乙二醇修饰类型 | 第25-28页 |
| 1.3.5.1 氨基修饰 | 第26-27页 |
| 1.3.5.2 巯基修饰 | 第27页 |
| 1.3.5.3 羧基的修饰 | 第27页 |
| 1.3.5.4 羰基定点修饰 | 第27页 |
| 1.3.5.5 酶催化的定点修饰 | 第27-28页 |
| 1.3.6 PEG修饰的影响因素 | 第28-29页 |
| 1.3.7 重组人干扰素β1b | 第29-32页 |
| 1.3.7.1 干扰素β的结构与性质 | 第29-30页 |
| 1.3.7.2 干扰素β1b的溶解性和稳定性 | 第30-31页 |
| 1.3.7.3 干扰素β的聚乙二醇修饰现状 | 第31-32页 |
| 1.4 抗体偶联药物 | 第32-42页 |
| 1.4.1 抗体偶联药物简介 | 第32-33页 |
| 1.4.2 抗体偶联药物的组成 | 第33-38页 |
| 1.4.2.1 抗体 | 第33-34页 |
| 1.4.2.2 偶联剂 | 第34-37页 |
| 1.4.2.3 效应分子 | 第37-38页 |
| 1.4.3 抗体偶联位点选择 | 第38-39页 |
| 1.4.3.1 抗体分子表面的赖氨酸基团 | 第38页 |
| 1.4.3.2 抗体分子还原而得到的游离巯基 | 第38页 |
| 1.4.3.2 基因工程方法引入的巯基或者非天然氨基酸 | 第38-39页 |
| 1.4.4 抗CD20抗体 | 第39-41页 |
| 1.4.4.1 CD20蛋白 | 第39页 |
| 1.4.4.2 抗CD20抗体 | 第39-41页 |
| 1.4.5 阿霉素 | 第41-42页 |
| 1.5 论文立题依据及研究内容 | 第42-46页 |
| 1.5.1 干扰素β1b聚乙二醇修饰研究依据及内容 | 第42-43页 |
| 1.5.2 聚乙二醇偶联制备抗体偶联药物的研究依据及内容 | 第43-44页 |
| 1.5.3 聚乙二醇偶联白蛋白和寡肽的可行性研究依据及内容 | 第44-46页 |
| 2 干扰素β1b的氮末端定点聚乙二醇修饰研究 | 第46-78页 |
| 2.1 材料与设备 | 第47-48页 |
| 2.2 实验方法 | 第48-58页 |
| 2.2.1 干扰素β1b的发酵 | 第48页 |
| 2.2.1.1 种子液培养 | 第48页 |
| 2.2.1.2 发酵罐培养 | 第48页 |
| 2.2.1.3 菌体的收集与破碎 | 第48页 |
| 2.2.2 干扰素β1b的分离纯化 | 第48-49页 |
| 2.2.2.1 有机相提取 | 第49页 |
| 2.2.2.2 硫酸铵沉淀 | 第49页 |
| 2.2.3 干扰素β1b的检测 | 第49-51页 |
| 2.2.3.1 蛋白浓度测定 | 第49页 |
| 2.2.3.2 SDS-PAGE电泳分析 | 第49-51页 |
| 2.2.3.3 高效液相色谱分析 | 第51页 |
| 2.2.3.4 干扰素β1b的氮末端氨基酸序列分析 | 第51页 |
| 2.2.4 干扰素β1b的N末端氧化及分离 | 第51-52页 |
| 2.2.4.1 干扰素β1b的N末端氧化 | 第51页 |
| 2.2.4.2 干扰素β1b氧化后除杂操作 | 第51页 |
| 2.2.4.3 MALDI-TOF质谱测定蛋白分子量 | 第51-52页 |
| 2.2.5 干扰素β1b的两种N末端修饰方法比较 | 第52-53页 |
| 2.2.5.1 mPEG_(5k)-HZ,mPEG_(5k)-ALD修饰IFN-β-1b的pH梯度实验 | 第52页 |
| 2.2.5.2 mPEG_(5k)-HZ,mPEG_(5k)-ALD修饰IFN-β-1b的投料比梯度实验 | 第52-53页 |
| 2.2.5.3 mPEG_(5k)-HZ,mPEG_(5k)-ALD修饰IFN-β-1b的时间梯度实验 | 第53页 |
| 2.2.6 mPEG_(20k)-HZ和mPEG_(20k)-ALD修饰IFN-β-1b | 第53-54页 |
| 2.2.6.1 mPEG_(20k)-HZ修饰IFN-β-1b | 第54页 |
| 2.2.6.2 mPEG_(20k)-ALD修饰IFN-β-1b | 第54页 |
| 2.2.7 修饰产物的分离纯化 | 第54页 |
| 2.2.8 修饰产物的凝胶过滤色谱分析 | 第54页 |
| 2.2.9 圆二色谱分析 | 第54-55页 |
| 2.2.10 荧光光谱分析 | 第55页 |
| 2.2.11 体外抗病毒活性检测 | 第55页 |
| 2.2.12 体外抗肿瘤细胞增殖活性检测 | 第55-56页 |
| 2.2.13 修饰产物的体内药代动力学测定 | 第56页 |
| 2.2.14 修饰产物的体内免疫原性测定 | 第56-58页 |
| 2.3 实验结果与讨论 | 第58-75页 |
| 2.3.1 IFN-β-1b的分离纯化 | 第58页 |
| 2.3.2 IFN-β-1b的氮末端氨基酸序列分析 | 第58-59页 |
| 2.3.3 IFN-β-1b的氮末端氧化 | 第59-61页 |
| 2.3.4 使用mPEG_(5k)-HZ和mPEG_(5k)-ALD修饰IFN-β-1b的比较 | 第61-67页 |
| 2.3.4.1 mPEG_(5k)-HZ,mPEG_(5k)-ALD修饰IFN-β-1b的pH梯度实验 | 第61-63页 |
| 2.3.4.2 mPEG_(5k)-HZ,mPEG_(5k)-ALD修饰IFN-β-1b的投料比梯度实验 | 第63-65页 |
| 2.3.4.3 mPEG_(5k)-HZ,mPEG_(5k)-ALD修饰IFN-β-1b的时间梯度实验 | 第65-67页 |
| 2.3.5 mPEG_(20k)-HZ和mPEG_(20k)-ALD修饰IFN-β-1b并分离纯化 | 第67-69页 |
| 2.3.6 纯化产物的凝胶过滤色谱分析 | 第69页 |
| 2.3.7 单修饰产物的MALDI-TOF分析 | 第69-70页 |
| 2.3.8 IFN-β-1b修饰前后的圆二色光谱检测 | 第70-71页 |
| 2.3.9 IFN-β-1b修饰前后的荧光光谱检测 | 第71页 |
| 2.3.10 IFN-β-1b修饰前后的抗病毒活性检测 | 第71-72页 |
| 2.3.11 IFN-β-1b修饰前后的抗肿瘤细胞增殖活性检测 | 第72-73页 |
| 2.3.12 IFN-β-1b修饰前后的药代动力学参数测定 | 第73-74页 |
| 2.3.13 IFN-β-1b修饰前后的免疫原性测定 | 第74-75页 |
| 2.4 本章小结 | 第75-78页 |
| 3 聚乙二醇偶联制备抗体偶联药物的研究 | 第78-116页 |
| 3.1 材料与设备 | 第79-80页 |
| 3.2 实验方法 | 第80-88页 |
| 3.2.1 奶粉中抗CD20抗体的分离纯化 | 第80页 |
| 3.2.2 抗CD20抗体经pepsin酶解并分离纯化得到F(ab’)_2片段 | 第80-81页 |
| 3.2.2.1 抗CD20抗体还原温度与还原时间确定 | 第80页 |
| 3.2.2.2 抗CD20抗体经pepsin酶解并分离纯化得到F(ab’)_2片段 | 第80-81页 |
| 3.2.3 F(ab’)_2还原并分离纯化得到Fab’片段 | 第81-82页 |
| 3.2.3.1 还原剂的筛选 | 第81页 |
| 3.2.3.2 还原时间的确定 | 第81-82页 |
| 3.2.3.3 F(ab’)_2还原并分离纯化得到Fab’片段 | 第82页 |
| 3.2.4 MAL-PEG-NHS和DOX的偶联反应 | 第82页 |
| 3.2.5 疏水层析分离MAL-PEG-NHS和DOX反应产物 | 第82-83页 |
| 3.2.6 MAL-PEG-DOX和Fab’的偶联反应与分离纯化 | 第83页 |
| 3.2.7 SDS-PAGE电泳分析 | 第83页 |
| 3.2.8 高效液相色谱分析 | 第83页 |
| 3.2.9 MALDI-TOF测定分子量 | 第83页 |
| 3.2.10 抗体片段偶联阿霉素载药量确定 | 第83-84页 |
| 3.2.10.1 紫外分光光度法下阿霉素标准曲线的绘制 | 第84页 |
| 3.2.10.2 紫外分光光度法下Fab’标准曲线的绘制 | 第84页 |
| 3.2.10.3 样品Fab’-PEG-DOX载药量的计算 | 第84页 |
| 3.2.11 Fab’-PEG-DOX的细胞毒性考察 | 第84-85页 |
| 3.2.12 激光共聚焦检测Fab’-PEG-DOX进入细胞的能力 | 第85页 |
| 3.2.13 流式细胞仪检测Fab’-PEG-DOX进入细胞情况 | 第85-86页 |
| 3.2.14 细胞ELISA检测IgG、Fab’、Fab’-PEG-DOX的结合能力 | 第86-87页 |
| 3.2.15 体内抗肿瘤活性实验 | 第87-88页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第88-112页 |
| 3.3.1 抗CD20抗体的纯化 | 第88-89页 |
| 3.3.2 抗CD20抗体经胃蛋白酶酶解并分离纯化得到F(ab’)_2片段 | 第89-93页 |
| 3.3.3 F(ab’)_2经巯基乙胺还原后分离纯化得到Fab’片段 | 第93-97页 |
| 3.3.3.1 还原剂的筛选 | 第93-94页 |
| 3.3.3.2 还原时间确定 | 第94-95页 |
| 3.3.3.3 F(ab’)_2还原成Fab’的分离纯化及检测 | 第95-97页 |
| 3.3.4 MAL-PEG-NHS和DOX的偶联反应 | 第97-100页 |
| 3.3.5 MAL-PEG-DOX和Fab’的偶联反应与分离纯化 | 第100-102页 |
| 3.3.6 抗体偶联药物载药量确定 | 第102-103页 |
| 3.3.7 Fab’-PEG-DOX的细胞毒性考察 | 第103-104页 |
| 3.3.8 激光共聚焦检测Fab’-PEG-DOX进入细胞的能力 | 第104-106页 |
| 3.3.9 流式细胞仪检测Fab’-PEG-DOX进入细胞情况 | 第106-107页 |
| 3.3.10 细胞ELISA检测IgG,Fab’,Fab’-PEG-DOX的结合能力 | 第107-108页 |
| 3.3.11 体内抗肿瘤活性 | 第108-112页 |
| 3.4 本章小结 | 第112-116页 |
| 4 聚乙二醇偶联白蛋白和寡肽的可行性研究 | 第116-136页 |
| 4.1 实验材料与设备 | 第116页 |
| 4.2 实验方法 | 第116-120页 |
| 4.2.1 SL8和TM11氧化的pH梯度实验 | 第116-117页 |
| 4.2.1.1 SL8肽氧化的pH梯度实验 | 第116-117页 |
| 4.2.1.2 TM11肽氧化的pH梯度实验 | 第117页 |
| 4.2.2 SL8和TM11氧化的时间梯度实验 | 第117页 |
| 4.2.2.1 SL8肽氧化的时间梯度实验 | 第117页 |
| 4.2.2.2 TM11肽氧化的时间梯度实验 | 第117页 |
| 4.2.3 SL8和TM11的氧化操作 | 第117-118页 |
| 4.2.3.1 SL8的氧化操作 | 第117页 |
| 4.2.3.2 TM11的氧化操作 | 第117-118页 |
| 4.2.4 SL8和TM11氧化后的分离 | 第118页 |
| 4.2.4.1 SL8氧化后的分离 | 第118页 |
| 4.2.4.2 TM11氧化后的分离 | 第118页 |
| 4.2.5 SL8和TM11氧化后与MAL-PEG-HZ的偶联 | 第118页 |
| 4.2.5.1 SL8氧化后与MAL-PEG-HZ的偶联 | 第118页 |
| 4.2.5.2 TM11氧化后与MAL-PEG-HZ的偶联 | 第118页 |
| 4.2.6 SL8和TM11偶联MAL-PEG-HZ后的分离纯化 | 第118-119页 |
| 4.2.6.1 SL8偶联MAL-PEG-HZ后的分离纯化 | 第118-119页 |
| 4.2.6.2 TM11偶联MAL-PEG-HZ后的分离纯化 | 第119页 |
| 4.2.7 SL8和TM11偶联HSA | 第119页 |
| 4.2.7.1 SL8偶联HSA | 第119页 |
| 4.2.7.2 TM11偶联HSA | 第119页 |
| 4.2.8 HPLC检测 | 第119页 |
| 4.2.9 LC-MS检测 | 第119页 |
| 4.2.10 MALDI-TOF检测 | 第119-120页 |
| 4.3 实验结果与讨论 | 第120-133页 |
| 4.3.1 SL8和TM11氧化的pH梯度结果 | 第120-122页 |
| 4.3.1.1 SL8氧化的pH梯度结果 | 第120-121页 |
| 4.3.1.2 TM11氧化的pH梯度结果 | 第121-122页 |
| 4.3.2 SL8和TM11氧化的时间梯度结果 | 第122-124页 |
| 4.3.2.1 SL8氧化的时间梯度 | 第122-123页 |
| 4.3.2.2 TM11氧化的时间梯度 | 第123-124页 |
| 4.3.3 SL8和TM11氧化结果 | 第124-125页 |
| 4.3.3.1 SL8实际氧化结果 | 第124-125页 |
| 4.3.3.2 TM11实际氧化结果 | 第125页 |
| 4.3.4 SL8和TM11氧化产物纯化 | 第125-127页 |
| 4.3.4.1 SL8氧化产物纯化 | 第125-126页 |
| 4.3.4.2 TM11氧化产物纯化 | 第126-127页 |
| 4.3.5 SL8和TM11氧化产物与MAL-PEG-HZ偶联 | 第127-128页 |
| 4.3.5.1 SL8氧化产物与MAL-PEG-HZ偶联 | 第127-128页 |
| 4.3.5.2 TM11氧化产物与MAL-PEG-HZ偶联 | 第128页 |
| 4.3.6 SL8和TM11偶联MAL-PEG-HZ后的分离纯化 | 第128-131页 |
| 4.3.6.1 SL8偶联MAL-PEG-HZ后的分离纯化 | 第128-130页 |
| 4.3.6.2 TM11偶联MAL-PEG-HZ后的分离纯化 | 第130-131页 |
| 4.3.7 SL8和TM11偶联HSA | 第131-133页 |
| 4.3.7.1 MAL-PEG-SL8偶联HSA | 第131-132页 |
| 4.3.7.2 MAL-PEG-TM11偶联HSA | 第132-133页 |
| 4.4 本章小结 | 第133-136页 |
| 5 结论和展望 | 第136-142页 |
| 5.1 本文的研究结果 | 第136-139页 |
| 5.2 本文的创新点 | 第139-140页 |
| 5.3 展望 | 第140-142页 |
| 参考文献 | 第142-154页 |
| 附录A 英文缩写对照表 | 第154-156页 |
| 个人简历及发表文章目录 | 第156-158页 |
| 致谢 | 第158-159页 |
