| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 缩略词 | 第11-13页 |
| 第一章 引言 | 第13-45页 |
| 1.1 Laron syndrome研究进展 | 第13-25页 |
| 1.1.1 Laron syndrome简介 | 第13-14页 |
| 1.1.2 Laron syndrome相关的GH-IGF-Ⅰ信号通路 | 第14-15页 |
| 1.1.3 Laron syndrome致病基因 | 第15-21页 |
| 1.1.4 GHI其它基因突变及表型 | 第21-22页 |
| 1.1.5 Laron syndrome疾病模型研究现状 | 第22-25页 |
| 1.2 基因组编辑工具研究进展 | 第25-44页 |
| 1.2.1 基因编辑研究简介 | 第25页 |
| 1.2.2 常用的基因编辑工具 | 第25-36页 |
| 1.2.3 基因编辑工具作用原理 | 第36-37页 |
| 1.2.4 基因组编辑工具的选择 | 第37-38页 |
| 1.2.5 基因组编辑工具的应用 | 第38-41页 |
| 1.2.6 基因组编辑工具效率的优化 | 第41-44页 |
| 1.3 本研究目的与意义 | 第44-45页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第45-64页 |
| 实验技术路线 | 第45-46页 |
| 2.1 实验材料 | 第46-51页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第46页 |
| 2.1.2 实验猪与细胞系 | 第46页 |
| 2.1.3 主要试剂与耗材 | 第46-48页 |
| 2.1.4 试剂配制 | 第48-49页 |
| 2.1.5 实验仪器 | 第49-51页 |
| 2.1.6 分析软件与工具 | 第51页 |
| 2.2 实验方法 | 第51-64页 |
| 2.2.1 组织和细胞基因组提取 | 第51-52页 |
| 2.2.2 组织和细胞RNA提取 | 第52页 |
| 2.2.3 组织和细胞蛋白提取 | 第52页 |
| 2.2.4 蛋白质定量 | 第52-53页 |
| 2.2.5 PCR | 第53页 |
| 2.2.6 PCR产物和酶切产物回收 | 第53-54页 |
| 2.2.7 外源片段与载体连接反应 | 第54页 |
| 2.2.8 感受态细胞制备 | 第54-55页 |
| 2.2.9 重组质粒鉴定 | 第55页 |
| 2.2.10 质粒提取 | 第55-57页 |
| 2.2.11 cDNA反转录 | 第57页 |
| 2.2.12 定量PCR | 第57页 |
| 2.2.13 Western blot | 第57-58页 |
| 2.2.14 细胞免疫荧光实验 | 第58-59页 |
| 2.2.15 酶联免疫吸附试验(ELISA试剂盒) | 第59页 |
| 2.2.16 单链核苷酸退火反应 | 第59-60页 |
| 2.2.17 TALENs质粒构建(单元组装法) | 第60页 |
| 2.2.18 CRISPR/Cas9质粒构建 | 第60页 |
| 2.2.19 CEL-Ⅰ酶切(SURVEYOR Mutation Detection Kit) | 第60-61页 |
| 2.2.20 T7E1酶切 | 第61页 |
| 2.2.21 电转染猪成纤维细胞 | 第61-62页 |
| 2.2.22 转染后细胞筛选 | 第62页 |
| 2.2.23 FuGENE转染 | 第62页 |
| 2.2.24 脂质体转染 | 第62-63页 |
| 2.2.25 核移植与克隆转基因猪的生成 | 第63页 |
| 2.2.26 小型猪采血 | 第63页 |
| 2.2.27 双荧光素酶活性检测 | 第63-64页 |
| 第三章 核酸酶介导GHR基因敲除 | 第64-81页 |
| 3.1 ZFNs介导GHR基因敲除 | 第64-66页 |
| 3.1.1 针对GHR基因exon 6位点的ZFNs设计及在酵母细胞中功能验证 | 第64-65页 |
| 3.1.2 ZFNs转染猪成纤维细胞条件优化 | 第65-66页 |
| 3.2 TALENs介导GHR基因敲除 | 第66-72页 |
| 3.2.1 TALENs介导GHR基因exon 6的基因突变 | 第66-67页 |
| 3.2.2 TALENs敲除GHR胞内域重要酪氨酸 | 第67-69页 |
| 3.2.3 TALENs敲除GHR exon 10及3'-UTR | 第69-71页 |
| 3.2.4 TALENs介导GHR基因长片段删除 | 第71-72页 |
| 3.3 CRISPR/Cas9介导的GHR基因敲除 | 第72-79页 |
| 3.3.1 CRISPR/Cas9敲除GHR exon 10及3'-UTR | 第72-76页 |
| 3.3.2 CRISPR/Cas9介导GHR基因长片段删除 | 第76-77页 |
| 3.3.3 CRISPR/Cas9介导GHR基因exon 6及胞内域重要酪氨酸的基因突变 | 第77-79页 |
| 3.4 实验结果讨论 | 第79-81页 |
| 第四章 锌指酶敲除GHR猪制备 | 第81-104页 |
| 4.1 F0代猪获得 | 第81-85页 |
| 4.1.1 锌指酶敲除GHR基因细胞单克隆鉴定 | 第81页 |
| 4.1.2 克隆点基因序列及蛋白质序列分析 | 第81-82页 |
| 4.1.3 脱靶位点分析 | 第82页 |
| 4.1.4 克隆猪的鉴定 | 第82-83页 |
| 4.1.5 克隆猪GHR mRNA水平鉴定 | 第83-84页 |
| 4.1.6 克隆猪体重变化分析 | 第84-85页 |
| 4.1.7 克隆猪GH-IGF-Ⅰ轴蛋白表达变化分析 | 第85页 |
| 4.2 GHR基因4 bp插入突变体的细胞水平验证 | 第85-94页 |
| 4.2.1 GHR基因4 bp插入转录本的获得及表达载体构建 | 第86-87页 |
| 4.2.2 转GHR基因4 bp插入和野生型转录本DF-1细胞单克隆的获得 | 第87-88页 |
| 4.2.3 转GHR基因4bp插入和野生型转录本细胞单克隆鉴定 | 第88-94页 |
| 4.3 GHR双等位基因敲除猪的获得 | 第94-102页 |
| 4.3.1 F1代单等位基因敲除猪的获得 | 第94-95页 |
| 4.3.2 F2代双等位基因敲除猪的获得 | 第95-96页 |
| 4.3.3 双等位基因敲除猪GHR基因及相关基因mRNA表达检测 | 第96-98页 |
| 4.3.4 双等位基因敲除猪GHR蛋白表达检测 | 第98页 |
| 4.3.5 双等位基因敲除猪生长特征变化分析 | 第98-99页 |
| 4.3.6 双等位基因敲除猪GH-IGF-Ⅰ轴蛋白表达变化分析 | 第99-100页 |
| 4.3.7 双等位基因敲除猪骨骼生长研究 | 第100-101页 |
| 4.3.8 双等位基因敲除猪血液中葡萄糖和脂肪含量测定 | 第101-102页 |
| 4.4 实验结果讨论 | 第102-104页 |
| 第五章 结论与展望 | 第104-105页 |
| 参考文献 | 第105-125页 |
| 致谢 | 第125-126页 |
| 附录 | 第126-136页 |
| 个人简历 | 第136页 |
