| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 引言 | 第12-18页 |
| 第2章 材料与方法 | 第18-60页 |
| 2.1 实验材料 | 第18-40页 |
| 2.1.1 菌种 | 第18页 |
| 2.1.2 质粒 | 第18-21页 |
| 2.1.3 引物序列 | 第21-27页 |
| 2.1.4 酶及化学试剂 | 第27-28页 |
| 2.1.5 主要仪器设备 | 第28-29页 |
| 2.1.6 培养基 | 第29-40页 |
| 2.2 实验方法 | 第40-60页 |
| 2.2.1 酵母Genomic DNA抽提 | 第40-41页 |
| 2.2.2 引物设计和PCR反应体系 | 第41-42页 |
| 2.2.3 PCR产物纯化回收 | 第42页 |
| 2.2.4 PCR片段和载体的酶切 | 第42-43页 |
| 2.2.5 酶切产物的回收 | 第43页 |
| 2.2.6 PCR片段和载体的酶连 | 第43页 |
| 2.2.7 制备DH5a感受态细胞及大肠杆菌的热击转化 | 第43-44页 |
| 2.2.8 菌落PCR对转化结果的验证 | 第44-45页 |
| 2.2.9 大肠杆菌质粒抽提及酶切验证 | 第45-46页 |
| 2.2.10 通过酵母电转化的方法将构建好的表达载体转入所需的酵母菌中 | 第46-47页 |
| 2.2.11 plasmid shuffling 策略 | 第47-48页 |
| 2.2.12 酵母菌落PCR | 第48页 |
| 2.2.13 Spotting assay | 第48页 |
| 2.2.14 酵母菌在SC-Leu培养基中的生长曲线 | 第48-49页 |
| 2.2.15 酵母菌质粒的抽提 | 第49-50页 |
| 2.2.16 β-半乳糖苷酶活性检测 | 第50-51页 |
| 2.2.17 酵母总RNA抽提 | 第51页 |
| 2.2.18 RNA变性电泳 | 第51-52页 |
| 2.2.19 RT-PCR | 第52-53页 |
| 2.2.20 Northern blot | 第53-55页 |
| 2.2.21 Western blot | 第55-58页 |
| 2.2.22 polysomal分析 | 第58-60页 |
| 第3章 结果与分析 | 第60-112页 |
| 3.1 酿酒酵母核糖蛋白基因L36B及课题前期工作介绍 | 第60-63页 |
| 3.2 实验结果 | 第63-112页 |
| 3.2.1 通过抽提酵母基因组DNA结合PCR的方法验证yRPL36B(△36)中内源的yRPL36A和yRPL36B已被敲除 | 第63页 |
| 3.2.2 利用RT-PCR的方法验证yRPL36B(△36)及mut1(△36) | 第63-65页 |
| 3.2.3 利用spotting assay方法检测yRPL36B突变对细胞生长的影响 | 第65-66页 |
| 3.2.4 利用phyre软件预测yRPL36B蛋白可能的空间结构 | 第66-67页 |
| 3.2.5 通过yRPL36B抗体检测突变相对野生型蛋白的表达情况 | 第67-68页 |
| 3.2.6 通过观察增强型绿色荧光蛋白EGFP来检测yRPL36B蛋白在细胞中的分布情况 | 第68-69页 |
| 3.2.7 突变的酵母RPL36B影响核糖蛋白的生成 | 第69-70页 |
| 3.2.8 利用Polysome analysis分析yRPL36B野生型和mut1(5'HA) | 第70-71页 |
| 3.2.9 利用有上游开放阅读框(uORF),易产生阅读框移码的,IRES(internal ribosome entry site)翻译表达报告基因系统检测yRPL36突变对ATG和阅读框识别的影响 | 第71-76页 |
| 3.2.10 通过functional specific软件,从转录和翻译两个水平上对yRPL36B突变基因芯片功能进行分类 | 第76-79页 |
| 3.2.11 基因芯片的结果显示yRPL36B的突变使参与核糖体合成基因的翻译效率呈现下调而与能量代谢相关基因的转录和翻译效率则呈现上调 | 第79-80页 |
| 3.2.12 分析总RNA芯片：yRPL36B in dele.36 us mut1和5M+B us YPC发现酵母核糖蛋白RPL36与其周围的核糖蛋白形成一个协同表达的复合体 | 第80-84页 |
| 3.2.13 针对yRPL36B in dele.36 us mut1的翻译芯片,分析参与核糖体组装和能量代谢相关基因的共调控特征 | 第84-88页 |
| 3.2.14 按家族在翻译水平上对yRPL36B突变的基因芯片进行分类并实验验证及构建相应基因的lacZ报告系统 | 第88-99页 |
| 3.2.15 在酵母菌y36B 111(△36)和mut1(5'HA)背景下,针对酵母基因ZUO1,LSG1引入myc标签 | 第99-100页 |
| 3.2.16 通过Spotting assay的方法检测ZUO1和LSG1引入的Myc标签对y36B 111(A36)和mut1(5'HA)生长的影响 | 第100-101页 |
| 3.2.17 在酵母菌y36B 111(△36)和mut1(5'HA)背景下,通过westernblot检测酵母基因ZUO1(myc),LSG1(myc)的蛋白表达 | 第101-102页 |
| 3.2.18 针对酵母基因ADE1,HTA2,NOP7构建lacZ报告基因 | 第102-107页 |
| 3.2.19 通过lacZ assay检测lacZ报告基因的表达活性 | 第107-108页 |
| 3.2.20 在25℃条件下,针对已转入报告基因的y36B 111(△36)和mut1(5'HA)生长状况的测量 | 第108-109页 |
| 3.2.21 利用polysomal analysis的方法抽提y36b 111(△36)和mut1(△36 )(含构建ADE1、HTA2、NOP7)的polysomal RNA及monosomal RNA | 第109-110页 |
| 3.2.22 通过spotting assay验证RPS14B突变菌 | 第110-112页 |
| 第4章 讨论与展望 | 第112-114页 |
| 4.1 关于yRPL36B的一系列突变菌 | 第112页 |
| 4.2 关于mut1(5'HA)的突变表象 | 第112-113页 |
| 4.3 关于yRPL36(dele.36)us mut1(5‘HA)总RNA芯片和翻译芯片 | 第113-114页 |
| 致谢 | 第114-115页 |
| 参考文献 | 第115-118页 |
