| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 1 引言 | 第12-18页 |
| 1.1 肺癌 | 第12页 |
| 1.2 DEK蛋白 | 第12-14页 |
| 1.3 肺癌中DEK蛋白的相关研究 | 第14-15页 |
| 1.4 RNA-Seq | 第15页 |
| 1.5 研究意义 | 第15-16页 |
| 1.6 研究目的和内容 | 第16-17页 |
| 1.6.1 研究目的 | 第16页 |
| 1.6.2 研究内容 | 第16-17页 |
| 1.7 技术路线 | 第17-18页 |
| 2 实验材料 | 第18-24页 |
| 2.1 细胞培养相关实验材料及主要试剂 | 第18页 |
| 2.1.1 细胞株 | 第18页 |
| 2.1.2 细胞培养所用主要试剂 | 第18页 |
| 2.2 DEK沉默相关实验材料及主要试剂 | 第18-19页 |
| 2.2.1 慢病毒载体、包装细胞和菌株 | 第18-19页 |
| 2.2.2 慢病毒包装所用主要试剂 | 第19页 |
| 2.3 siRNA与RT-PCR引物序列 | 第19-20页 |
| 2.4 主要试剂盒与相关试剂 | 第20-21页 |
| 2.5 主要溶液配制 | 第21-23页 |
| 2.6 主要仪器设备 | 第23-24页 |
| 3 实验方法 | 第24-37页 |
| 3.1 肺癌细胞系的复苏、培养与冻存 | 第24-25页 |
| 3.1.1 肺癌细胞系的复苏 | 第24页 |
| 3.1.2 肺癌细胞系的培养 | 第24页 |
| 3.1.3 肺癌细胞系的冻存 | 第24-25页 |
| 3.2 肺癌细胞系总RNA的提取以及RT-PCR检测mRNA表达水平 | 第25-27页 |
| 3.2.1 肺癌细胞系总RNA的提取 | 第25-26页 |
| 3.2.2 RT-PCR合成cDNA第一链 | 第26-27页 |
| 3.2.3 实时荧光定量RT-PCR | 第27页 |
| 3.3 Western Blotting检测蛋白表达水平 | 第27-30页 |
| 3.3.1 所用抗体的最佳稀释比例及蛋白分子量大小 | 第27-28页 |
| 3.3.2 肺癌细胞系总蛋白的提取 | 第28页 |
| 3.3.3 SDS-PAGE凝胶配制 | 第28-29页 |
| 3.3.4 SDS-PAGE电泳 | 第29页 |
| 3.3.5 转膜(半干转)以及封闭 | 第29页 |
| 3.3.6 一抗、二抗孵育 | 第29-30页 |
| 3.3.7 ECL化学反应发光法显影曝光 | 第30页 |
| 3.4 DEK沉默A549细胞系的构建 | 第30-33页 |
| 3.4.1 慢病毒干扰质粒载体的构建 | 第30页 |
| 3.4.2 慢病毒包装和浓缩 | 第30-33页 |
| 3.4.3 病毒感染A549细胞 | 第33页 |
| 3.5 RNA-seq测序 | 第33-34页 |
| 3.5.1 差异基因筛选 | 第33页 |
| 3.5.2 Go分析 | 第33页 |
| 3.5.3 Pathway分析 | 第33-34页 |
| 3.6 A549细胞转染 | 第34页 |
| 3.7 MTT细胞增殖检测实验 | 第34页 |
| 3.8 细胞周期检测实验 | 第34-35页 |
| 3.9 Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测实验 | 第35页 |
| 3.10 统计学分析 | 第35-37页 |
| 4 实验结果 | 第37-60页 |
| 4.1 筛选肺癌细胞系中内源性高表达DEK的细胞 | 第37-38页 |
| 4.2 DEK沉默的A549细胞测序样本的准备 | 第38页 |
| 4.3 DEK沉默对A549细胞转录组的影响 | 第38-48页 |
| 4.3.1 差异表达基因的检测 | 第38-40页 |
| 4.3.2 差异表达基因Go功能分析 | 第40-44页 |
| 4.3.3 差异表达基因Pathway分析 | 第44-48页 |
| 4.4 A549肺腺癌细胞中DEK基因的沉默 | 第48-52页 |
| 4.4.1 实时荧光定量RT-PCR筛选DEK基因沉默效果最佳的siRNA | 第49-50页 |
| 4.4.2 实时荧光定量RT-PCR检测转染DEK siRNA-2后DEK mRNA表达量 | 第50-51页 |
| 4.4.3 Western Blotting检测转染DEK siRNA-2后DEK蛋白表达量 | 第51-52页 |
| 4.5 DEK沉默对A549细胞功能的影响 | 第52-58页 |
| 4.5.1 MTT法检测DEK沉默对细胞增殖能力的影响 | 第52-53页 |
| 4.5.2 PI染色检测DEK沉默对细胞周期的影响 | 第53-55页 |
| 4.5.3 Annexin V-FITC/PI检测DEK沉默对细胞凋亡的影响 | 第55-58页 |
| 4.6 DEK沉默对A549细胞功能影响分子机制的初步研究 | 第58-60页 |
| 4.6.1 实时荧光定量RT-PCR检测DEK沉默对IGFBP3/IGF-1R通路相关基因mRNA表达水平的影响 | 第58-59页 |
| 4.6.2 Western Blotting检测DEK沉默对IGFBP3、IGF-1R、AKT、p-AKT蛋白表达水平的影响 | 第59-60页 |
| 5 讨论 | 第60-65页 |
| 6 结论 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-73页 |
| 附录A | 第73-74页 |
| 英语缩略词表 | 第73-74页 |
| 作者简历及攻读硕士学位期间取得的研究成果 | 第74-76页 |
| 学位论文数据集 | 第76页 |
