草酸脱羧酶的晶体制备及响应面优化mPEG修饰条件的研究
| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-10页 |
| 1 前言 | 第10-21页 |
| ·研究背景 | 第10-13页 |
| ·草酸的来源及性质 | 第10页 |
| ·草酸的危害 | 第10-11页 |
| ·自然界草酸降解酶 | 第11页 |
| ·草酸脱羧酶来源及理化性质 | 第11-12页 |
| ·草酸脱羧酶的研究进展 | 第12-13页 |
| ·蛋白质结晶技术 | 第13-17页 |
| ·蛋白质结晶原理 | 第13页 |
| ·蛋白质结晶方法 | 第13-15页 |
| ·分批结晶 | 第13页 |
| ·液-液扩散结晶 | 第13页 |
| ·蒸气扩散 | 第13-14页 |
| ·透析法 | 第14-15页 |
| ·蛋白质的结晶过程 | 第15页 |
| ·成核 | 第15页 |
| ·生长 | 第15页 |
| ·停止生长 | 第15页 |
| ·影响蛋白质结晶的因素 | 第15-17页 |
| ·蛋白质的纯度 | 第15-16页 |
| ·过饱和度 | 第16页 |
| ·温度 | 第16页 |
| ·pH 值 | 第16页 |
| ·结晶剂 | 第16页 |
| ·压力及外加物理场 | 第16-17页 |
| ·其他因素 | 第17页 |
| ·蛋白质的化学修饰 | 第17-19页 |
| ·蛋白质化学修饰的类型 | 第17-18页 |
| ·侧链基团的修饰 | 第17页 |
| ·主链结构的修饰 | 第17-18页 |
| ·修饰剂类型 | 第18页 |
| ·蛋白质的聚乙二醇修饰 | 第18-19页 |
| ·聚乙二醇的性质 | 第18页 |
| ·聚乙二醇的用途 | 第18-19页 |
| ·响应面优化法 | 第19-20页 |
| ·响应面定义 | 第19页 |
| ·实验设计与建模分析 | 第19-20页 |
| ·研究目的及意义 | 第20-21页 |
| 2 草酸脱羧酶的表达及诱导条件的优化 | 第21-29页 |
| ·主要材料 | 第21-22页 |
| ·培养基及菌种 | 第21页 |
| ·主要试剂 | 第21-22页 |
| ·主要仪器 | 第22页 |
| ·实验方法 | 第22-23页 |
| ·草酸脱羧酶的制备 | 第22页 |
| ·快速蛋白层析系统（FPLC）对草酸脱羧酶的纯化 | 第22-23页 |
| ·包涵体的检测 | 第23页 |
| ·酶活性的检测 | 第23页 |
| ·生长曲线的测定 | 第23页 |
| ·诱导条件对重组草酸脱羧酶表达的影响 | 第23页 |
| ·正交试验 | 第23页 |
| ·结果与分析 | 第23-28页 |
| ·草酸脱羧酶在大肠杆菌中的重组表达 | 第23-24页 |
| ·生长曲线 | 第24页 |
| ·发酵液初始 pH 对诱导表达的影响 | 第24-25页 |
| ·诱导时机对诱导表达的影响 | 第25页 |
| ·诱导时间对诱导表达的影响 | 第25-26页 |
| ·IPTG 浓度对诱导表达的影响 | 第26-27页 |
| ·锰离子浓度对诱导表达的影响 | 第27页 |
| ·正交试验结果 | 第27-28页 |
| ·小结 | 第28-29页 |
| 3 草酸脱羧酶晶体制备条件的初步探索 | 第29-38页 |
| ·实验材料 | 第29-30页 |
| ·培养基及菌种 | 第29页 |
| ·主要试剂 | 第29-30页 |
| ·主要仪器 | 第30页 |
| ·方法 | 第30-33页 |
| ·草酸脱羧酶的制备 | 第30页 |
| ·快速蛋白质液相系统(FPLC)纯化草酸脱羧酶 | 第30-31页 |
| ·草酸脱羧酶纯酶液的浓缩 | 第31页 |
| ·草酸脱羧酶的结晶 | 第31页 |
| ·悬滴法 | 第31页 |
| ·静置法 | 第31页 |
| ·蛋白质 SDS-PAGE 电泳 | 第31-33页 |
| ·场发射扫描电镜分析 | 第33页 |
| ·结果与分析 | 第33-37页 |
| ·草酸脱羧酶的表达浓缩 | 第33页 |
| ·草酸脱羧酶的晶体制备 | 第33-35页 |
| ·SDS-PAGE 结果分析 | 第35-36页 |
| ·晶体表面的表征分析 | 第36-37页 |
| ·小结 | 第37-38页 |
| 4 mPEG-醛对草酸脱羧酶的修饰研究 | 第38-48页 |
| ·实验材料 | 第38-39页 |
| ·培养基及菌种 | 第38页 |
| ·主要试剂 | 第38-39页 |
| ·主要仪器 | 第39页 |
| ·实验方法 | 第39-41页 |
| ·草酸脱羧酶的制备及纯化 | 第39-40页 |
| ·草酸脱羧酶的酶活检测 | 第40页 |
| ·mPEG-醛的制备及活化率的测定 | 第40页 |
| ·草酸脱羧酶 mPEG 化的单因素优化 | 第40-41页 |
| ·红外光谱分析 | 第41页 |
| ·SDS-PAGE 分析 | 第41页 |
| ·酶学性质的研究 | 第41页 |
| ·最适 PH | 第41页 |
| ·温度对酶活的影响 | 第41页 |
| ·对胰蛋白酶的耐受性 | 第41页 |
| ·结果与分析 | 第41-46页 |
| ·草酸脱羧酶 mPEG 化的单因素优化 | 第41-44页 |
| ·mPEG-醛/Oxdc 摩尔比 | 第41-42页 |
| ·反应 pH | 第42页 |
| ·反应温度 | 第42-43页 |
| ·反应时间 | 第43-44页 |
| ·IR 分析结果 | 第44页 |
| ·SDS-PAGE 分析 | 第44-45页 |
| ·部分酶学性质的比较 | 第45-46页 |
| ·最适 pH | 第45页 |
| ·温度对酶活的影响 | 第45-46页 |
| ·对胰蛋白酶的耐受性 | 第46页 |
| ·小结 | 第46-48页 |
| 5 响应面优化草酸脱羧酶 mPEG 化条件的研究 | 第48-59页 |
| ·实验材料 | 第48-49页 |
| ·培养基及菌种 | 第48页 |
| ·主要试剂 | 第48-49页 |
| ·主要仪器 | 第49页 |
| ·方法 | 第49-52页 |
| ·草酸脱羧酶的制备 | 第49-50页 |
| ·快速蛋白层析系统对草酸脱羧酶的纯化 | 第50页 |
| ·酶活性的检测 | 第50页 |
| ·mPEG-醛的制备及活化率测定 | 第50页 |
| ·草酸脱羧酶的 mPEG-醛修饰 | 第50-51页 |
| ·响应面实验设计 | 第51页 |
| ·模型的验证 | 第51-52页 |
| ·结果分析 | 第52-58页 |
| ·方差分析 | 第52-55页 |
| ·不同因素间的交互作用 | 第55-58页 |
| ·优化反应条件和模型验证 | 第58页 |
| ·小结 | 第58-59页 |
| 6 结论与展望 | 第59-61页 |
| ·结论 | 第59-60页 |
| ·展望 | 第60-61页 |
| 参考文献 | 第61-65页 |
| 致谢 | 第65-66页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 | 第66页 |
