| 致谢 | 第1-4页 |
| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-12页 |
| 前言 | 第12-14页 |
| 1.课题研究的目的和意义 | 第12页 |
| 2.课题研究的主要内容 | 第12-13页 |
| 3.课题研究创新点 | 第13-14页 |
| 第一章 绪论 | 第14-28页 |
| ·漆酶的概述 | 第14-18页 |
| ·漆酶的来源 | 第14页 |
| ·漆酶的理化性质及结构特点 | 第14-16页 |
| ·漆酶的催化机制 | 第16-18页 |
| ·漆酶的生物学特性 | 第18页 |
| ·漆酶的分子生物学研究进展 | 第18-22页 |
| ·漆酶基因的克隆及表达 | 第18-20页 |
| ·漆酶基因的结构和组织分析 | 第20页 |
| ·漆酶基因的改造 | 第20-22页 |
| ·巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统 | 第22-24页 |
| ·毕赤酵母表达外源蛋白的优点 | 第22页 |
| ·表达载体 | 第22-23页 |
| ·宿主菌株 | 第23页 |
| ·影响外源基因在毕赤酵母中稳定高效表达的因素 | 第23-24页 |
| ·漆酶的应用研究进展 | 第24-28页 |
| ·环境保护中的应用 | 第24-25页 |
| ·生物修复 | 第25-26页 |
| ·造纸工业中的应用 | 第26页 |
| ·农产品加工业中的应用 | 第26页 |
| ·医药行业中的应用 | 第26页 |
| ·漆酶与能源利用 | 第26-28页 |
| 第二章 变色栓菌漆酶基因的克隆 | 第28-46页 |
| ·实验材料 | 第28-30页 |
| ·菌株及质粒 | 第28页 |
| ·药品与酶 | 第28页 |
| ·培养基与主要试剂的配置 | 第28-30页 |
| ·主要仪器 | 第30页 |
| ·实验方法 | 第30-36页 |
| ·种子活化 | 第30页 |
| ·种子摇瓶培养 | 第30页 |
| ·变色栓菌总 RNA 的提取 | 第30-31页 |
| ·引物设计 | 第31页 |
| ·将 mRNA 反转录为 cDNA 一链 | 第31-32页 |
| ·变色栓菌漆酶基因的克隆 | 第32-33页 |
| ·琼脂糖凝胶核酸电泳 | 第33页 |
| ·目的片段的回收 | 第33页 |
| ·DNA 浓缩 | 第33-34页 |
| ·PCR 产物 TA 克隆 | 第34页 |
| ·重组质粒转化大肠杆菌 | 第34页 |
| ·质粒小量提取 | 第34-35页 |
| ·重组质粒的 PCR 验证 | 第35-36页 |
| ·目的基因的全序列测定 | 第36页 |
| ·结果与分析 | 第36-45页 |
| ·总 RNA 提取 | 第36-37页 |
| ·全序列的获得 | 第37页 |
| ·全阳性克隆子的筛选与鉴定 | 第37-38页 |
| ·核苷酸序列及同源性分析 | 第38-45页 |
| ·小结 | 第45-46页 |
| 第三章 变色栓菌漆酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第46-63页 |
| ·实验材料 | 第46-48页 |
| ·菌株及质粒 | 第46页 |
| ·药品与酶 | 第46-47页 |
| ·培养基及主要试剂配制 | 第47-48页 |
| ·主要仪器 | 第48页 |
| ·实验方法 | 第48-54页 |
| ·引物设计 | 第48页 |
| ·目的基因的 PCR 扩增 | 第48-49页 |
| ·PCR 扩增产物的割胶回收 | 第49页 |
| ·目的基因的双酶切 | 第49页 |
| ·表达载体的双酶切 | 第49-50页 |
| ·表达质粒的构建 | 第50页 |
| ·感受态细胞 TOP10F’的制备与转化 | 第50页 |
| ·重组质粒的筛选 | 第50页 |
| ·重组质粒的大量提取 | 第50-51页 |
| ·重组质粒的线性化 | 第51页 |
| ·毕赤酵母超级感受态细胞制备 | 第51-52页 |
| ·毕赤酵母的电击转化 | 第52页 |
| ·酵母重组子的筛选 | 第52页 |
| ·重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达 | 第52页 |
| ·毕赤酵母工程菌蛋白的 SDS-PAGE 电泳 | 第52-53页 |
| ·漆酶活力测定 | 第53-54页 |
| ·漆酶酶学性质 | 第54页 |
| ·结果与分析 | 第54-62页 |
| ·漆酶基因的 PCR 扩增 | 第54页 |
| ·漆酶基因及表达载体的双酶切 | 第54-55页 |
| ·漆酶基因与表达载体的连接和阳性表达质粒的筛选 | 第55页 |
| ·重组质粒的大量提取及表达载体线性化 | 第55-56页 |
| ·酵母的电击转化 | 第56页 |
| ·重组酵母阳性筛选 | 第56-57页 |
| ·重组变色栓菌漆酶在不同毕赤酵母中的诱导表达 | 第57-58页 |
| ·毕赤酵母工程菌蛋白的电泳 | 第58页 |
| ·酶学性质 | 第58-62页 |
| ·小结 | 第62-63页 |
| 第四章 漆酶基因的定向改造及其高效表达 | 第63-81页 |
| ·实验材料 | 第63-64页 |
| ·菌株及质粒 | 第63页 |
| ·药品与酶 | 第63页 |
| ·培养基及主要试剂配制 | 第63-64页 |
| ·主要仪器 | 第64页 |
| ·实验方法 | 第64-71页 |
| ·引物设计 | 第64-65页 |
| ·改造依据 | 第65-66页 |
| ·定点突变 | 第66-67页 |
| ·突变后的重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达 | 第67页 |
| ·单因素对表达的影响 | 第67-68页 |
| ·多因素对表达的影响 | 第68-69页 |
| ·高密度发酵产漆酶 | 第69-71页 |
| ·结果与分析 | 第71-80页 |
| ·不同信号肽 | 第71-72页 |
| ·添加增强子结果 | 第72-73页 |
| ·单因素对表达的影响 | 第73-77页 |
| ·多因素对表达的影响[72-74] | 第77-79页 |
| ·高密度发酵的结果 | 第79-80页 |
| ·小结 | 第80-81页 |
| 第五章 变色栓菌漆酶在染料脱色中的应用 | 第81-95页 |
| ·实验材料 | 第81-82页 |
| ·菌株及质粒 | 第81页 |
| ·实验药品 | 第81页 |
| ·培养基及主要试剂配制 | 第81-82页 |
| ·主要仪器 | 第82页 |
| ·实验方法 | 第82-84页 |
| ·酶液的制备 | 第82页 |
| ·漆酶酶活测定 | 第82-83页 |
| ·不同底物下的漆酶的最适温度与最适 pH | 第83页 |
| ·米氏常数测定 | 第83页 |
| ·降解的反应体系 | 第83-84页 |
| ·结果与分析 | 第84-94页 |
| ·变色栓菌漆酶在不同底物下的最适反应温度及最适 pH | 第84-85页 |
| ·重组变色栓菌漆酶同工酶动力学常数测定 | 第85页 |
| ·重组变色栓菌漆酶同工酶对对苯二酚的降解 | 第85-88页 |
| ·重组变色栓菌漆酶同工酶对染料的脱色 | 第88-94页 |
| ·小结 | 第94-95页 |
| 第六章 漆酶 lacA 基因与木聚糖酶 xynB 基因在毕赤酵母中的融合表达 | 第95-111页 |
| ·实验材料 | 第95-96页 |
| ·菌株及质粒 | 第95页 |
| ·药品与酶 | 第95页 |
| ·培养基与主要试剂的配置 | 第95-96页 |
| ·主要仪器 | 第96页 |
| ·实验方法 | 第96-101页 |
| ·单因素对木聚糖酶表达的影响 | 第96页 |
| ·引物设计 | 第96-97页 |
| ·克隆方案 | 第97-99页 |
| ·表达质粒的构建 | 第99页 |
| ·表达质粒的转化与筛选 | 第99页 |
| ·表达质粒的线性化、电击转化 | 第99页 |
| ·酵母重组子的筛选及诱导表达 | 第99-100页 |
| ·木聚糖酶酶活与漆酶酶活的测定 | 第100-101页 |
| ·结果与分析 | 第101-110页 |
| ·木聚糖酶表达条件的优化 | 第101-103页 |
| ·木聚糖酶基因 xynB 及漆酶基因 lacA 的 PCR 扩增 | 第103页 |
| ·通过连接肽的顺序融合木聚糖酶基因 xynB 及漆酶基因 lacA | 第103-104页 |
| ·全阳性克隆子的筛选与鉴定 | 第104-108页 |
| ·融合基因及表达载体的双酶切 | 第108页 |
| ·重组质粒的大量提取及表达载体线性化 | 第108-109页 |
| ·酵母的电击转化 | 第109页 |
| ·重组酵母阳性筛选 | 第109页 |
| ·重组变色栓菌漆酶在不同毕赤酵母中的诱导表达 | 第109-110页 |
| ·小结 | 第110-111页 |
| 第七章 结论与展望 | 第111-118页 |
| ·结论 | 第111-112页 |
| ·讨论与展望 | 第112-118页 |
| 参考文献 | 第118-124页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第124页 |
