| 摘要 | 第1-14页 |
| ABSTRACT | 第14-16页 |
| 1 引言 | 第16-26页 |
| ·本研究的目的和意义 | 第16-17页 |
| ·文献综述 | 第17-25页 |
| ·漆酶及其性质 | 第17-19页 |
| ·漆酶的分布 | 第19-20页 |
| ·漆酶的应用 | 第20-22页 |
| ·环境治理 | 第20-21页 |
| ·造纸工业 | 第21页 |
| ·生物检测 | 第21页 |
| ·食品工业 | 第21-22页 |
| ·绿色有机合成 | 第22页 |
| ·漆酶基因的克隆 | 第22-23页 |
| ·漆酶的异源表达 | 第23-25页 |
| ·本论文的主要研究内容 | 第25-26页 |
| 2 材料与方法 | 第26-42页 |
| ·试验材料 | 第26-28页 |
| ·菌种与载体 | 第26页 |
| ·试剂及酶类 | 第26页 |
| ·常用试剂的配制 | 第26-27页 |
| ·培养基 | 第27-28页 |
| ·仪器 | 第28页 |
| ·试验方法 | 第28-42页 |
| ·漆酶高产黑木耳菌株的筛选 | 第28-29页 |
| ·黑木耳活化和平板培养 | 第28页 |
| ·氧化带测定 | 第28-29页 |
| ·液体发酵培养 | 第29页 |
| ·酶活性测定方法 | 第29页 |
| ·黑木耳DNA 的提取 | 第29页 |
| ·黑木耳总RNA 的提取 | 第29-30页 |
| ·文库筛选黑木耳漆酶基因 | 第30-34页 |
| ·建立基于位点专一重组分泌表达载体 | 第30页 |
| ·黑木耳cDNA 文库的构建 | 第30-32页 |
| ·黑木耳 cDNA 文库的共转化 | 第32-33页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第33-34页 |
| ·阳性克隆测序 | 第34页 |
| ·漆酶基因的克隆 | 第34-37页 |
| ·引物设计 | 第34-35页 |
| ·利用PCR 扩增目的片段 | 第35页 |
| ·目的片段的回收 | 第35页 |
| ·目的片段的加“A”反应 | 第35-36页 |
| ·连接反应 | 第36页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备 | 第36页 |
| ·大肠杆菌的转化 | 第36页 |
| ·质粒的提取 | 第36-37页 |
| ·重组子的鉴定 | 第37页 |
| ·测序及序列分析 | 第37页 |
| ·毕赤酵母表达载体的构建 | 第37-38页 |
| ·毕赤酵母表达载体的转化 | 第38-39页 |
| ·毕赤酵母感受态的制备 | 第38页 |
| ·毕赤酵母的电击转化 | 第38页 |
| ·重组子的鉴定 | 第38-39页 |
| ·重组酵母的表达 | 第39-40页 |
| ·诱导型重组子的表达 | 第39页 |
| ·组成型重组子的表达 | 第39-40页 |
| ·漆酶活力测定 | 第40页 |
| ·SDS-PAGE 分析 | 第40页 |
| ·发酵液 pH 对重组漆酶产量的影响 | 第40页 |
| ·重组漆酶的酶学性质分析 | 第40-42页 |
| ·重组漆酶的最适反应 pH 和 pH 稳定性 | 第40-41页 |
| ·重组漆酶的最适反应温度和热稳定性 | 第41-42页 |
| 3 结果与分析 | 第42-72页 |
| ·漆酶高产黑木耳菌株的筛选 | 第42-44页 |
| ·氧化带测量 | 第42页 |
| ·酶活测定 | 第42-44页 |
| ·漆酶基因的克隆 | 第44-57页 |
| ·文库筛选获得漆酶基因 | 第44-48页 |
| ·建立基于位点专一重组的分泌表达载体 | 第44-46页 |
| ·黑木耳cDNA 文库的构建 | 第46-47页 |
| ·共转化酵母Y187 | 第47页 |
| ·PCR 筛选阳性克隆 | 第47-48页 |
| ·阳性克隆测序结果的分析 | 第48页 |
| ·漆酶基因的扩增 | 第48-57页 |
| ·漆酶基因 cDNA 的扩增 | 第48-50页 |
| ·漆酶基因 cDNA 的结构分析 | 第50-56页 |
| ·漆酶基因组全长的获得与结构分析 | 第56页 |
| ·lac cDNA 的克隆 | 第56-57页 |
| ·毕赤酵母表达载体的构建 | 第57-63页 |
| ·诱导型表达载体 pPIC9-lac 的构建 | 第57-58页 |
| ·诱导型表达载体pPIC-lac1 的构建 | 第58-60页 |
| ·组成型表达载体pGAPHα-lac 的构建 | 第60-61页 |
| ·组成型表达载体pGAPH-lac1 的构建 | 第61-63页 |
| ·毕赤酵母表达载体的转化 | 第63-67页 |
| ·诱导型表达载体 pPIC9-lac 和 pPIC-lac1 的转化与鉴定 | 第63-65页 |
| ·组成型表达载体 pGAPHα-lac 和 pGAPH-lac1 的转化与鉴定 | 第65-67页 |
| ·漆酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第67-69页 |
| ·诱导型表达载体 pPIC9-lac 和 pPIC-lac1 的表达 | 第67-68页 |
| ·组成型表达载体 pGAPHα-lac 和 pGAPH-lac1 的表达 | 第68页 |
| ·蛋白性质的检测 | 第68-69页 |
| ·发酵液 pH 对重组漆酶产量的影响 | 第69-70页 |
| ·重组漆酶的酶学性质分析 | 第70-72页 |
| ·重组漆酶的最适反应 pH 和 pH 稳定性 | 第70-71页 |
| ·重组漆酶的最适反应温度和热稳定性 | 第71-72页 |
| 4 讨论 | 第72-75页 |
| ·基因供体的选择 | 第72页 |
| ·基于位点专一重组的漆酶基因筛选系统的建立 | 第72页 |
| ·Taq 酶的选择 | 第72-73页 |
| ·毕赤酵母的转化 | 第73页 |
| ·毕赤酵母转化子的PCR 鉴定 | 第73页 |
| ·信号肽的选择 | 第73-75页 |
| 5 结论 | 第75-76页 |
| ·漆酶高产黑木耳菌株的筛选 | 第75页 |
| ·漆酶基因的筛选与克隆 | 第75页 |
| ·表达载体的构建 | 第75页 |
| ·漆酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第75页 |
| ·发酵液 pH 对重组漆酶产量的影响 | 第75页 |
| ·GS115-pPIC9-lac 酶学性质分析 | 第75-76页 |
| 致谢 | 第76-77页 |
| 参考文献 | 第77-83页 |
| 附录 | 第83-89页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第89页 |
