| 摘要 | 第1-11页 |
| ABSTRACT | 第11-15页 |
| 引言 | 第15-16页 |
| 1、文献综述 | 第16-39页 |
| ·金黄色葡萄球菌和食物中毒 | 第16-27页 |
| ·金黄色葡萄球菌的发现历史 | 第16-17页 |
| ·金黄色葡萄球菌基本特征 | 第17-18页 |
| ·金黄色葡萄球菌生态学特征 | 第18页 |
| ·金黄色葡萄球菌肠毒素种类 | 第18-22页 |
| ·金黄色葡萄球菌肠毒素活性 | 第22-23页 |
| ·影响金黄色葡萄球菌肠毒素产生的环境因素 | 第23页 |
| ·金黄色葡萄球菌食物中毒 | 第23-25页 |
| ·与金黄色葡萄球菌中毒相关的食物 | 第25-26页 |
| ·金黄色葡萄球菌产毒株发生率 | 第26-27页 |
| ·金黄色葡萄球菌耐热核酸酶及其编码基因 | 第27-28页 |
| ·金黄色葡萄球菌毒力基因调控及其表达 | 第28-37页 |
| ·双组分调节系统 | 第29-34页 |
| ·SarA蛋白家族 | 第34-37页 |
| ·研究目的 | 第37-39页 |
| 2、金黄色葡萄球菌菌株的验证与特征分析 | 第39-49页 |
| ·材料与方法 | 第39-44页 |
| ·菌株 | 第39-40页 |
| ·培养基 | 第40页 |
| ·主要试剂及配制 | 第40-41页 |
| ·培养方法 | 第41页 |
| ·金黄色葡萄球菌革兰氏染色 | 第41页 |
| ·金黄色葡萄球菌API检测 | 第41-43页 |
| ·SDS-PAGE样品制备 | 第43页 |
| ·SDS-PAGE检测 | 第43页 |
| ·金黄色葡萄球菌肠毒素引物的合成 | 第43-44页 |
| ·金黄色葡萄球菌DNA的提取 | 第44页 |
| ·金黄色葡萄球菌肠毒素基因的PCR扩增 | 第44页 |
| ·结果与分析 | 第44-47页 |
| ·菌株形态比较 | 第44页 |
| ·生化特征比较 | 第44-45页 |
| ·胞外分泌蛋白的比较 | 第45-46页 |
| ·肠毒素基因的验证 | 第46-47页 |
| ·讨论 | 第47-49页 |
| 3、产肠毒素金黄色葡萄球菌快速检测方法的研究 | 第49-64页 |
| ·材料与方法 | 第49-56页 |
| ·菌株 | 第49-50页 |
| ·培养基 | 第50页 |
| ·主要试剂 | 第50页 |
| ·主要仪器设备 | 第50-51页 |
| ·菌种活化与培养 | 第51页 |
| ·基因组DNA提取方法 | 第51-52页 |
| ·DNA得率和质量检测 | 第52页 |
| ·金黄色葡萄球菌分离株和李斯特氏杆菌DNA的提取 | 第52页 |
| ·方法4提取DNA的评价 | 第52页 |
| ·双重PCR引物的设计与合成 | 第52-53页 |
| ·双重PCR扩增条件的优化 | 第53-55页 |
| ·人工污染牛奶的检测方法 | 第55-56页 |
| ·结果与分析 | 第56-62页 |
| ·不同方法提取DNA的得率 | 第56页 |
| ·其它菌株DNA的提取 | 第56-57页 |
| ·方法4提取DNA的PCR扩增验证 | 第57页 |
| ·nuc2基因BLAST结果与分析 | 第57-58页 |
| ·双重PCR均匀设计及优化 | 第58页 |
| ·双重PCR引物的验证和特异性比较 | 第58-59页 |
| ·双重PCR引物抗干扰能力的比较 | 第59-60页 |
| ·双重PCR引物敏感性的比较 | 第60页 |
| ·金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶实验 | 第60-61页 |
| ·人工污染牛奶的检测 | 第61-62页 |
| ·讨论 | 第62-64页 |
| 4、金黄色葡萄球菌耐热核酸酶及其编码基因的研究 | 第64-109页 |
| ·材料与方法 | 第64-84页 |
| ·菌株 | 第64页 |
| ·培养基 | 第64-65页 |
| ·质粒 | 第65-68页 |
| ·主要试剂及溶液的配制 | 第68-70页 |
| ·主要仪器设备 | 第70页 |
| ·耐热核酸酶的分析方法 | 第70-71页 |
| ·不同培养条件下的金黄色葡萄球菌的生长测定 | 第71页 |
| ·金黄色葡萄球菌菌落总数的测定 | 第71-72页 |
| ·引物的设计与合成 | 第72页 |
| ·DNA模板制备 | 第72页 |
| ·PCR扩增 | 第72-73页 |
| ·PCR产物及载体的酶切、回收与纯化 | 第73-74页 |
| ·DNA片断的连接 | 第74页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第74-75页 |
| ·原核表达质粒的构建 | 第75-76页 |
| ·连接产物的转化 | 第76页 |
| ·重组质粒的快速鉴定 | 第76-77页 |
| ·质粒的提取 | 第77页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第77-78页 |
| ·重组蛋白Nuc1和Nuc2的诱导表达 | 第78页 |
| ·重组蛋白的SDS-PAGE检测 | 第78页 |
| ·同源重组质粒pBT2Δnuc1的构建 | 第78-80页 |
| ·电转化感受态细胞的制备 | 第80页 |
| ·穿梭质粒的电转化 | 第80页 |
| ·金黄色葡萄球菌中质粒的提取 | 第80页 |
| ·金黄色葡萄球菌nuc1缺失突变株的筛选 | 第80-81页 |
| ·金黄色葡萄球菌nuc1缺失突变株的PCR鉴定 | 第81页 |
| ·金黄色葡萄球菌nuc1缺失突变株的RT-PCR鉴定 | 第81-83页 |
| ·金黄色葡萄球菌S.aureus RN4220和RNΔnuc1样品制备 | 第83页 |
| ·互补质粒的构建 | 第83-84页 |
| ·结果与分析 | 第84-102页 |
| ·pH值对耐热核酸酶和菌液O.D.值的影响 | 第84页 |
| ·不同生长时间对耐热核酸酶的产生和菌落总数的影响 | 第84-85页 |
| ·NaCl浓度对耐热核酸酶和菌液O.D.值的影响 | 第85页 |
| ·100℃处理时间对耐热核酸酶活性的影响 | 第85页 |
| ·nuc1和nuc2片段的扩增 | 第85-86页 |
| ·重组质粒pET17-nuc2和pET28-nuc2的酶切鉴定 | 第86-87页 |
| ·重组质粒pET17-nuc1和pET28-nuc1的酶切鉴定 | 第87-88页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE检测 | 第88-89页 |
| ·重组蛋白SNase和TNase的活性分析 | 第89页 |
| ·两个耐热核酸酶同源性比较 | 第89-90页 |
| ·TNase和SNase空间结构预测与比较 | 第90-91页 |
| ·信号肽和跨膜区域的分析 | 第91-92页 |
| ·nuc1基因同源上游和下游片段的PCR扩增 | 第92-93页 |
| ·中间质粒pUC19Δnuc1的构建 | 第93-95页 |
| ·同源重组质粒pBT2Δnuc1的构建 | 第95-96页 |
| ·质粒pBT2 Δnuc1的鉴定 | 第96-97页 |
| ·金黄色葡萄球菌nuc1缺失突变株的获得 | 第97-98页 |
| ·金黄色葡萄球菌nuc1缺失突变株的PCR验证 | 第98页 |
| ·金黄色葡萄球菌nuc1缺失突变株的RT-PCR验证 | 第98-99页 |
| ·S.aureus RN4220和RNΔnuc1耐热核酸酶活性比较 | 第99-100页 |
| ·RN4220和突变株RNΔnuc1胞外分泌蛋白的对比 | 第100页 |
| ·质粒PSM1058的转化及表达 | 第100-101页 |
| ·金黄色葡萄球菌nuc1基因互补片段的获得 | 第101页 |
| ·互补载体pBT2-NUC1C的构建 | 第101-102页 |
| ·互补载体pBT2-NUC1C的电转化及互补菌株的耐热核酸酶分析 | 第102页 |
| ·讨论 | 第102-109页 |
| ·不同培养条件对耐热核酸酶活性及菌体生物量的影响 | 第102-103页 |
| ·nuc1和nuc2基因的克隆与表达 | 第103-105页 |
| ·同源重组质粒pBT_2Δnuc1的构建 | 第105-106页 |
| ·同源重组质粒pBT_2Δnuc1的电转化 | 第106-107页 |
| ·金黄色葡萄球菌nuc1缺失突变株的筛选与鉴定 | 第107页 |
| ·nuc1缺失突变株与野生株耐热核酶活性的对比研究 | 第107-108页 |
| ·金黄色葡萄球菌nuc1缺失突变株的互补分析 | 第108-109页 |
| 5、金黄色葡萄球菌调控基因agr及sae对耐热核酸酶的影响 | 第109-126页 |
| ·材料与方法 | 第110-117页 |
| ·菌株 | 第110页 |
| ·培养基 | 第110页 |
| ·质粒 | 第110页 |
| ·质粒的提取、纯化 | 第110页 |
| ·金黄色葡萄球菌基因组的提取 | 第110页 |
| ·sae基因上下游同源臂的PCR扩增 | 第110-111页 |
| ·同源重组质粒pBT2Δsae的构建 | 第111-114页 |
| ·电转化感受态细胞的制备 | 第114页 |
| ·穿梭质粒的电转化 | 第114页 |
| ·转化质粒的鉴定 | 第114-115页 |
| ·金黄色葡萄球菌sae缺失突变株筛选方法 | 第115页 |
| ·金黄色葡萄球菌sae缺失突变株的PCR鉴定方法 | 第115-116页 |
| ·金黄色葡萄球菌sae缺失突变株的RT-PCR鉴定方法 | 第116-117页 |
| ·细菌培养方法 | 第117页 |
| ·耐热核酸酶活性的测定方法 | 第117页 |
| ·SDS-PAGE | 第117页 |
| ·结果与分析 | 第117-123页 |
| ·sae基因同源的上游和下游两段PCR产物的获得 | 第117页 |
| ·构建同源重组质粒pBT_2Δsae | 第117-119页 |
| ·pBT_2-SaeF的构建 | 第117-118页 |
| ·pBT_2-SaeF-SaeB的构建 | 第118页 |
| ·pBT_2Δsae的构建 | 第118-119页 |
| ·转化质粒pBT_2Δsae的鉴定 | 第119-120页 |
| ·金黄色葡萄球菌sae缺失突变株的获得 | 第120-121页 |
| ·突变株的PCR验证 | 第121页 |
| ·突变株的RT-PCR验证 | 第121-122页 |
| ·agr位点突变对耐热核酸酶分泌的影响 | 第122页 |
| ·sae位点突变对耐热核酸酶分泌的影响 | 第122页 |
| ·亲本株RN4220和突变株RNΔsae的胞外蛋白比较分析 | 第122-123页 |
| ·讨论 | 第123-126页 |
| ·同源重组质粒pBT_2Δsae的构建 | 第123-124页 |
| ·同源重组质粒pBT_2Δsae的转化 | 第124页 |
| ·金黄色葡萄球菌sae缺失突变株的筛选与鉴定 | 第124页 |
| ·agr和sae调节位点对耐热核酸酶分泌的影响 | 第124-126页 |
| 6、结论及展望 | 第126-128页 |
| ·结论 | 第126页 |
| ·特色和创新 | 第126-127页 |
| ·展望 | 第127-128页 |
| 参考文献 | 第128-142页 |
| 致谢 | 第142-144页 |
| 附录 | 第144页 |
