| 第一章 前言 | 第1-27页 |
| 第一节 脂肪酶 | 第9-13页 |
| 1. 脂肪酶简介 | 第9-10页 |
| 2. 脂肪酶的基因研究 | 第10页 |
| 3. 脂肪酶的催化机理 | 第10-11页 |
| 4. 脂肪酶的性质研究 | 第11-13页 |
| 第二节 枯草杆菌 | 第13-18页 |
| 1. 枯草杆菌简介 | 第13-14页 |
| 2. 枯草杆菌基因表达系统 | 第14-17页 |
| 3 . 外源蛋白在枯草杆菌中的表达机制 | 第17-18页 |
| 第三节 定向进化 | 第18-21页 |
| 1 . 定向进化的原理 | 第18页 |
| 2. 定向进化的策略 | 第18-20页 |
| 3. 定向进化的筛选策略 | 第20页 |
| 4. 定向进化的应用 | 第20-21页 |
| 第四节 本论文的立题依据和研究内容 | 第21-23页 |
| 参考文献 | 第23-27页 |
| 第二章 枯草杆菌脂肪酶的基因克隆、表达纯化与表征. . | 第27-59页 |
| 第一节 引言 | 第27页 |
| 第二节 枯草杆菌脂肪酶重组质粒的构建 | 第27-40页 |
| 1、实验材料 | 第29-30页 |
| 2、实验方法 | 第30-37页 |
| ·双链DNA的合成 | 第30-31页 |
| ·质粒DNA 的小量制备 | 第31-32页 |
| ·从琼脂糖凝胶中回收DNA | 第32页 |
| ·从细菌中小量制备基因组DNA | 第32页 |
| ·引物设计 | 第32页 |
| ·目的基因的PCR 扩增和纯化 | 第32-33页 |
| ·PCR 产物的酶切和纯化 | 第33-34页 |
| ·载体DNA 的限制性酶切、纯化和去磷酸化 | 第34页 |
| ·目的基因与载体的连接 | 第34页 |
| ·枯草杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第34-35页 |
| ·单克隆菌株的筛选与鉴定 | 第35页 |
| ·目的基因的序列测定 | 第35-37页 |
| 3、结果与讨论 | 第37-40页 |
| ·引入DNA 片段的设计与获得 | 第37-38页 |
| ·重组质粒的构建 | 第38-40页 |
| ·质粒载体的提取、酶切、纯化及磷酸化处理 | 第38页 |
| ·目的基因的克隆、限制性酶切及纯化 | 第38-39页 |
| ·目的基因与引入的DNA 片段、质粒载体的连接 | 第39-40页 |
| ·重组质粒的转化及鉴定 | 第40页 |
| 第三节 枯草杆菌脂肪酶的表达与纯化 | 第40-48页 |
| 1、实验材料 | 第41-42页 |
| 2、实验方法 | 第42-45页 |
| ·生长表达曲线 | 第42页 |
| ·脂肪酶粗酶的制备 | 第42-43页 |
| ·脂肪酶的分离纯化 | 第43页 |
| ·脂肪酶的活力测定 | 第43页 |
| ·蛋白浓度的测定 | 第43页 |
| ·蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第43-44页 |
| ·蛋白质的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第44-45页 |
| 3、结果与讨论 | 第45-48页 |
| ·枯草杆菌生长表达曲线 | 第45-46页 |
| ·脂肪酶的分离纯化 | 第46-47页 |
| ·纯化脂肪酶的SDS-PAGE 电泳和活力染色 | 第47-48页 |
| 第四节 枯草杆菌脂肪酶的基本酶学性质 | 第48-57页 |
| 1、实验材料 | 第48-49页 |
| 2、实验方法 | 第49-50页 |
| ·温度对酶活力的影响 | 第49页 |
| ·pH 对酶活力的影响 | 第49页 |
| ·脂肪酶的稳定性 | 第49页 |
| ·酶反应动力学 | 第49-50页 |
| ·底物特异性 | 第50页 |
| ·金属离子和表面活性剂对酶活力的影响 | 第50页 |
| ·胆酸钠盐对酶活力的影响 | 第50页 |
| ·酶活力测定 | 第50页 |
| 3、结果与讨论 | 第50-57页 |
| ·温度对酶活力的影响 | 第50-51页 |
| ·pH 对酶活力的影响 | 第51-52页 |
| ·底物特异性 | 第52-53页 |
| ·酶反应动力学 | 第53-54页 |
| ·金属离子和表面活性剂对酶活力的影响 | 第54-56页 |
| ·胆酸钠盐对酶活力的影响 | 第56-57页 |
| 本章小结 | 第57页 |
| 参考文献 | 第57-59页 |
| 第三章 枯草杆菌脂肪酶的定向进化 | 第59-79页 |
| 第一节 引言 | 第59页 |
| 第二节易错PCR 和DNA 重组对枯草杆菌脂肪酶的定向进化. | 第59-76页 |
| 1、实验材料 | 第59-61页 |
| 2、实验方法 | 第61-67页 |
| ·质粒DNA 的小量制备 | 第61-62页 |
| ·从琼脂糖凝胶中回收DNA | 第62页 |
| ·从细菌中小量制备基因组DNA | 第62-63页 |
| ·引物设计 | 第63页 |
| ·易错PCR | 第63-64页 |
| ·DNA 改组 | 第64-65页 |
| ·易错PCR 和DNA 重组产物的酶切和纯化 | 第65页 |
| ·载体DNA 的限制性酶切、纯化和去磷酸化 | 第65-66页 |
| ·突变库的构建 | 第66-67页 |
| ·高活力菌株的筛选 | 第67页 |
| ·突变体活力测定 | 第67页 |
| ·脂肪酶的分离纯化 | 第67页 |
| ·突变体的热稳定性 | 第67页 |
| ·突变体的pH 稳定性 | 第67页 |
| ·突变基因的序列测定 | 第67页 |
| 3、实验结果 | 第67-75页 |
| ·易错PCR 突变库的构建和筛选结果 | 第67-68页 |
| ·DNA 重组突变库的构建和筛选结果 | 第68-69页 |
| ·突变体的最适温度和稳定性 | 第69页 |
| ·突变体的最适pH 值和稳定性 | 第69-70页 |
| ·突变体的基因的序列测定及蛋白质结构预测 | 第70-75页 |
| 4、讨论 | 第75-76页 |
| ·突变库的库容 | 第75页 |
| ·筛选方法 | 第75-76页 |
| ·定向进化方案 | 第76页 |
| 本章小结 | 第76-77页 |
| 参考文献 | 第77-79页 |
| 中文摘要 | 第79-81页 |
| 英文摘要 | 第81-84页 |
| 致谢 | 第84页 |