| 提要 | 第1-11页 |
| 第一章 前言 | 第11-53页 |
| ·蛋白质工程方法简介 | 第11-23页 |
| ·蛋白质的理性设计 | 第12-16页 |
| ·针对关键氨基酸残基的酶理性设计 | 第12-14页 |
| ·酶分子基本骨架微调 | 第14-15页 |
| ·酶分子结构元件嫁接 | 第15-16页 |
| ·蛋白质非理性设计——定向进化 | 第16-20页 |
| ·定向进化的原理及目的 | 第16-17页 |
| ·定向进化中突变文库的构建方法 | 第17-19页 |
| ·突变基因的筛选和选择 | 第19-20页 |
| ·蛋白质的半理性设计 | 第20-23页 |
| ·特定区域突变 | 第21-22页 |
| ·随机突变后的定点饱和突变 | 第22页 |
| ·计算机辅助的半理性设计 | 第22-23页 |
| ·酰基肽水解酶apAPH 简介 | 第23-28页 |
| ·脯氨酸寡肽酶家族简介 | 第23-25页 |
| ·超嗜热酰基肽水解酶apAPH 简介 | 第25-26页 |
| ·apAPH 的潜在应用价值 | 第26-28页 |
| ·手性化合物拆分 | 第26-27页 |
| ·聚酯合成 | 第27-28页 |
| ·作为检测环境中有机磷毒物的生物标志物 | 第28页 |
| ·apAPH 的定向进化研究 | 第28页 |
| ·β-1,3-糖基转移酶CgtB 简介 | 第28-39页 |
| ·糖基转移酶家族简介 | 第28-33页 |
| ·糖基转移酶家族 | 第29页 |
| ·糖基转移酶结构特征 | 第29-30页 |
| ·糖基转移酶的分类 | 第30-31页 |
| ·糖基转移酶的催化机制 | 第31-33页 |
| ·β-1,3-糖基转移酶CgtB 简介 | 第33-34页 |
| ·CgtB 的工业应用潜力 | 第34-37页 |
| ·肿瘤相关T 抗原的合成 | 第34-35页 |
| ·GM_1 类神经节苷脂的合成 | 第35-37页 |
| ·糖基转移酶的定向进化 | 第37-39页 |
| ·本论文立项依据和实验流程设计 | 第39-42页 |
| ·参考文献 | 第42-53页 |
| 第二章 超嗜热酰基肽水解酶/酯酶的半理性设计 | 第53-75页 |
| ·引言 | 第53页 |
| ·实验方法 | 第53-58页 |
| ·同源序列比对 | 第53-54页 |
| ·蛋白质三级结构比对 | 第54页 |
| ·全质粒PCR 构建定点饱和突变库 | 第54-55页 |
| ·饱和突变库的筛选 | 第55-56页 |
| ·野生型apAPH 及其突变体的表达及粗酶获得 | 第56页 |
| ·野生型apAPH 及其突变体的镍亲和柱纯化 | 第56页 |
| ·酯酶、肽酶活力测定 | 第56-57页 |
| ·动力学常数测定 | 第57页 |
| ·野生型apAPH 及突变体底物复合物模型构建 | 第57页 |
| ·分子动力学模拟（MDS） | 第57-58页 |
| ·实验结果 | 第58-71页 |
| ·半理性设计思路的确立及突变位点选择 | 第58-61页 |
| ·Arg526 饱和突变库的建立及筛选 | 第61-62页 |
| ·突变体的纯化与性质鉴定 | 第62-64页 |
| ·计算机建模 | 第64-68页 |
| ·分子动力学模拟 | 第68-71页 |
| ·讨论 | 第71-73页 |
| ·小结 | 第73页 |
| ·参考文献 | 第73-75页 |
| 第三章 跨结构域盐桥对apAPH 酶活性和稳定性的调节作用 | 第75-101页 |
| ·引言 | 第75页 |
| ·材料与方法 | 第75-79页 |
| ·定点突变体的构建 | 第75-76页 |
| ·野生型apAPH 及其突变体的表达、纯化 | 第76页 |
| ·动力学常数测定 | 第76页 |
| ·最适pH 和催化基团解离常数的测定 | 第76-77页 |
| ·无机盐对酶活力的影响 | 第77页 |
| ·不同浓度磷酸缓冲液和NaCl 对酶活力的影响 | 第77页 |
| ·温度对酶催化的影响及催化热力学的测定 | 第77-78页 |
| ·酶热稳定动力学的测定 | 第78页 |
| ·差式扫描量热（DSC）测定酶变性温度 | 第78页 |
| ·酶在盐酸胍中的变性过程测定 | 第78页 |
| ·野生型apAPH 及突变体底物复合物模型构建 | 第78页 |
| ·野生型apAPH 及突变体的分子动力学模拟（MDS） | 第78-79页 |
| ·实验结果及讨论 | 第79-98页 |
| ·跨结构域盐桥突变体的设计及活性变化 | 第79-82页 |
| ·离子强度对酶活性的影响 | 第82-86页 |
| ·pH 对酶活性的影响 | 第86-89页 |
| ·温度对酶催化的影响及突变体分子柔性的变化 | 第89-92页 |
| ·热稳定性的变化 | 第92-95页 |
| ·野生型apAPH 及突变体的分子动力学模拟 | 第95-98页 |
| ·小结 | 第98-99页 |
| ·参考文献 | 第99-101页 |
| 第四章 β-1，3-糖基转移酶的定向进化研究 | 第101-128页 |
| ·引言 | 第101页 |
| ·材料与方法 | 第101-106页 |
| ·随机突变库的构建 | 第101-102页 |
| ·DNA 改组突变库的构建 | 第102页 |
| ·CgtB 活力的高通量筛选 | 第102-103页 |
| ·CgtB 定点突变体的构建 | 第103-104页 |
| ·CgtB 在大肠杆菌的过量表达及蛋白质纯化 | 第104页 |
| ·糖基转移酶活力测定 | 第104-106页 |
| ·CgtB 野生型及其突变体的动力学常数测定 | 第106页 |
| ·实验结果及讨论 | 第106-126页 |
| ·高通量筛选方法的建立 | 第106-113页 |
| ·FACS 筛选的策略及底物分子设计 | 第106-109页 |
| ·高通量筛选方法的建立 | 第109-113页 |
| ·随机突变库的建立及筛选 | 第113-117页 |
| ·随机突变库的建立 | 第113-114页 |
| ·随机突变库的筛选 | 第114-117页 |
| ·基因改组突变库的建立及筛选 | 第117-122页 |
| ·基因改组突变库的建立 | 第117-119页 |
| ·基因改组突变库的筛选 | 第119-122页 |
| ·CgtB 定点突变体的设计与构建、表达、纯化 | 第122-126页 |
| ·定点突变体的设计与构建 | 第122页 |
| ·突变体的表达与纯化 | 第122-123页 |
| ·突变体的活力变化 | 第123-125页 |
| ·突变体的动力学常数测定 | 第125-126页 |
| ·小结 | 第126页 |
| ·参考文献 | 第126-128页 |
| 创新点 | 第128-129页 |
| 作者简历 | 第129页 |
| 博士期间已发表和待发表的文章 | 第129-130页 |
| 负责或参与的研究课题 | 第130-131页 |
| 致谢 | 第131-132页 |
| 摘要 | 第132-135页 |
| Abstract | 第135-139页 |