| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-9页 |
| 第一章 绪论 | 第9-15页 |
| ·立题意义 | 第9页 |
| ·国内外的研究进展 | 第9-14页 |
| ·脂肪酶简介 | 第9-11页 |
| ·脂肪酶的催化机理 | 第11页 |
| ·米根霉脂肪酶的外源表达 | 第11-12页 |
| ·米根霉脂肪酶的应用 | 第12-13页 |
| ·外源基因在毕赤酵母中的表达 | 第13页 |
| ·共表达伴侣蛋白对毕赤酵母表达量的影响 | 第13-14页 |
| ·本课题的研究思路、研究内容与课题来源 | 第14-15页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第15-24页 |
| ·主要试剂、菌种与仪器 | 第15-17页 |
| ·实验方法 | 第17-24页 |
| ·米根霉全基因组的提取 | 第17页 |
| ·ProROL 基因引物设计及PCR | 第17页 |
| ·PCR 扩增产物的克隆与测序 | 第17页 |
| ·pPIC9K-ProROL 表达载体的构建 | 第17页 |
| ·重组毕赤酵母菌株的构建 | 第17-18页 |
| ·ProROL 重组菌的筛选与验证 | 第18页 |
| ·利用SOE-PCR 构建ProAROL 基因 | 第18-19页 |
| ·ProAROL 表达载体的构建 | 第19页 |
| ·PCR 依赖型方法电转化宿主菌 | 第19页 |
| ·ProAROL 重组菌株的筛选与验证 | 第19-20页 |
| ·重组菌株拷贝数的定量 | 第20页 |
| ·阳性菌株的诱导表达 | 第20-21页 |
| ·酶活、总蛋白浓度及SDS-PAGE 分析 | 第21-22页 |
| ·重组脂肪酶的分离纯化 | 第22页 |
| ·温度对酶活力及其稳定性的影响 | 第22页 |
| ·pH 对酶活力及其稳定性的影响 | 第22页 |
| ·重组脂肪酶的碳链长度选择性 | 第22-23页 |
| ·重组脂肪酶反应动力学参数的测定 | 第23页 |
| ·水解法测定酶的1,3-位置特异性 | 第23页 |
| ·重组脂肪酶酯合成活性的测定 | 第23-24页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第24-45页 |
| ·ProROL 基因在毕赤酵母中的表达 | 第24-29页 |
| ·米根霉全基因组的提取与ProROL 基因的获得 | 第24页 |
| ·ProROL 基因的克隆载体、表达载体的构建与测序 | 第24-25页 |
| ·表达质粒电转化毕赤酵母及阳性菌株筛选与表型鉴定 | 第25-26页 |
| ·重组菌株的摇瓶发酵 | 第26-27页 |
| ·重组菌株的7 L 罐发酵 | 第27-29页 |
| ·米根霉脂肪酶的定向分子改造及其在毕赤酵母中的表达 | 第29-36页 |
| ·SOE PCR 获得ProAROL 基因 | 第30-31页 |
| ·表达质粒pPIC9K- ProAROL 的构建 | 第31页 |
| ·PCR 依赖型方法电转化 GS115 和 GS115/PDI/Ero1p | 第31-32页 |
| ·阳性菌株的筛选与鉴定 | 第32-33页 |
| ·ProAROL 重组菌株拷贝数定量 | 第33页 |
| ·ProAROL 重组菌株的摇瓶发酵 | 第33-35页 |
| ·ProAROL 重组菌株的7 L 罐发酵 | 第35-36页 |
| ·重组脂肪酶ProROL 和ProAROL 的分离纯化 | 第36-40页 |
| ·HiTrap SP FF 强阳离子交换柱层析 | 第36-37页 |
| ·HiTrap Phenyl HP 疏水色谱柱层析 | 第37-38页 |
| ·重组脂肪酶纯化效果 | 第38-40页 |
| ·重组脂肪酶酶学性质的测定 | 第40-45页 |
| ·温度对酶活力及酶稳定性的影响 | 第40-41页 |
| ·pH 对酶活力及稳定性的影响 | 第41页 |
| ·重组脂肪酶的碳链长度选择性 | 第41-42页 |
| ·重组脂肪酶反应动力学参数 | 第42页 |
| ·水解法测定重组脂肪酶的1,3-位置特异性 | 第42-43页 |
| ·重组脂肪酶酯合成活性的测定 | 第43-45页 |
| 主要结论及展望 | 第45-47页 |
| 致谢 | 第47-48页 |
| 参考文献 | 第48-52页 |
| 附录：作者在攻读硕士发表的论文 | 第52页 |
