| 中文摘要 | 第2-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 中文文摘 | 第6-13页 |
| 绪论 | 第13-35页 |
| 1.1 简介 | 第13-21页 |
| 1.1.1 蛋白质的热稳定性 | 第13页 |
| 1.1.2 蛋白质热稳定性类型 | 第13-14页 |
| 1.1.3 热稳定性蛋白酶的优点 | 第14页 |
| 1.1.4 热稳定性酶的应用 | 第14-15页 |
| 1.1.5 酶的热失活 | 第15页 |
| 1.1.6 影响蛋白质热稳定性的因素 | 第15-21页 |
| 1.1.6.1 疏水相互作用 | 第16页 |
| 1.1.6.2 氢键 | 第16页 |
| 1.1.6.3 盐桥 | 第16-17页 |
| 1.1.6.4 二硫键 | 第17页 |
| 1.1.6.5 芳香环的相互作用 | 第17页 |
| 1.1.6.6 包装效率 | 第17-18页 |
| 1.1.6.7 稳定的α-螺旋结构 | 第18页 |
| 1.1.6.8 氨基酸的组成 | 第18-20页 |
| 1.1.6.9 不稳定区域的锚定 | 第20页 |
| 1.1.6.10 寡聚化 | 第20页 |
| 1.1.6.11 亚基之间的相互作用 | 第20-21页 |
| 1.1.6.12 翻译后修饰 | 第21页 |
| 1.1.6.13 与金属离子结合 | 第21页 |
| 1.2 酶稳定性改造的策略和研究进展 | 第21-28页 |
| 1.2.1 理性设计 | 第21-23页 |
| 1.2.2 非理性设计 | 第23-27页 |
| 1.2.3 半理性设计 | 第27-28页 |
| 1.3 定向进化筛选策略 | 第28-32页 |
| 1.3.1 表型观察选择和筛选 | 第28-29页 |
| 1.3.2 微孔板滴定法 | 第29页 |
| 1.3.3 各种展示技术 | 第29-31页 |
| 1.3.4 流式细胞分选技术 | 第31-32页 |
| 1.4 B因子简介 | 第32页 |
| 1.5 本课题研究的思路及意义 | 第32-35页 |
| 第一章 扩展青霉脂肪酶83,92及151位点突变体文库的构建和筛选 | 第35-47页 |
| 1.1 前言 | 第35页 |
| 1.2 材料 | 第35-36页 |
| 1.2.1 菌株与质粒 | 第35页 |
| 1.2.2 主要试剂 | 第35-36页 |
| 1.2.3 主要仪器 | 第36页 |
| 1.2.4 主要试剂及培养基配置 | 第36页 |
| 1.3 实验方法 | 第36-41页 |
| 1.3.1 设计寡核苷酸引物 | 第36-37页 |
| 1.3.2 重组质粒PET-47b(+)-PEL的构建 | 第37-38页 |
| 1.3.3 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备及质粒的转化 | 第38-40页 |
| 1.3.4 脂肪酶突变体的筛选 | 第40-41页 |
| 1.3.5 脂肪酶突变体的鉴定 | 第41页 |
| 1.4 结果 | 第41-45页 |
| 1.4.1 PET-47b(+)质粒验证 | 第41页 |
| 1.4.2 PET片段鉴定 | 第41页 |
| 1.4.3 PET-47b(+)-PEL质粒鉴定 | 第41-42页 |
| 1.4.4 突变体质粒验证 | 第42-43页 |
| 1.4.5 稳定性提高突变体的筛选 | 第43-45页 |
| 1.5 讨论 | 第45-47页 |
| 第二章 扩展青霉脂肪酶多拷贝基因工程菌的构建 | 第47-57页 |
| 2.1 前言 | 第47页 |
| 2.2 材料 | 第47页 |
| 2.2.1 菌体 | 第47页 |
| 2.2.2 主要试剂 | 第47页 |
| 2.2.3 主要仪器设备 | 第47页 |
| 2.3 实验方法 | 第47-51页 |
| 2.3.1 设计寡核苷酸引物 | 第47-48页 |
| 2.3.2 有EcoRⅠ酶切位点PEL片段的获得 | 第48页 |
| 2.3.3 pAO815质粒提取 | 第48页 |
| 2.3.4 一拷贝克隆载体pAO815-PEL的构建 | 第48-49页 |
| 2.3.5 TOP10感受态的制备和转化 | 第49页 |
| 2.3.6 重组质粒pAO815-PEL的鉴定 | 第49-50页 |
| 2.3.7 多拷贝表达载体pAO815-xlip的构建 | 第50-51页 |
| 2.4 结果与分析 | 第51-54页 |
| 2.4.1 pAO815-LIP单拷贝表达载体的构建 | 第51页 |
| 2.4.2 多拷贝表达载体pAO815-XLIP的构建 | 第51-54页 |
| 2.5 讨论 | 第54-57页 |
| 第三章 多拷贝基因工程菌的脂肪酶表达及酶学性质的研究 | 第57-79页 |
| 3.1 前言 | 第57-58页 |
| 3.2 材料 | 第58-59页 |
| 3.2.1 菌株 | 第58页 |
| 3.2.2 主要试剂 | 第58页 |
| 3.2.3 主要仪器 | 第58-59页 |
| 3.3 实验方法 | 第59-61页 |
| 3.3.1 毕赤酵母GS115感受态的制备与转化 | 第60-61页 |
| 3.3.2 重组酵母的鉴定及诱导表达 | 第61页 |
| 3.3.3 SDS-PAGE鉴定 | 第61页 |
| 3.4 重组酵母脂肪酶酶学性质测定 | 第61-63页 |
| 3.4.1 测重组酵母脂肪酶酶活 | 第61-62页 |
| 3.4.2 重组酵母脂肪酶的酶活单位定义 | 第62页 |
| 3.4.3 对硝基苯酚的标准曲线测定 | 第62页 |
| 3.4.4 用不同浓度的乙醇处理测突变脂肪酶的稳定性 | 第62页 |
| 3.4.5 用相同浓度的乙醇处理不同时间测突变脂肪酶的稳定性 | 第62页 |
| 3.4.6 用相同浓度的不同有机溶剂处理测突变脂肪酶的稳定性 | 第62页 |
| 3.4.7 用不同温度处理测突变脂肪酶的稳定性 | 第62-63页 |
| 3.4.8 在40℃处理不同的时间测突变脂肪酶的稳定性 | 第63页 |
| 3.5 实验结果与分析 | 第63-71页 |
| 3.5.1 多拷贝基因工程菌GS-pAO815-xlip的筛选 | 第63-64页 |
| 3.5.2 脂肪酶的诱导表达 | 第64-65页 |
| 3.5.3 对硝基苯酚标准曲线 | 第65-66页 |
| 3.5.4 突变脂肪酶比活力分析 | 第66页 |
| 3.5.5 突变脂肪酶稳定性测定 | 第66-71页 |
| 3.6 分析与讨论 | 第71-79页 |
| 第四章 总结与展望 | 第79-83页 |
| 4.1 创新点 | 第79页 |
| 4.2 总结 | 第79-81页 |
| 4.3 展望 | 第81-83页 |
| 参考文献 | 第83-91页 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 | 第91-93页 |
| 致谢 | 第93-95页 |
| 个人简历 | 第95-99页 |
