| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 主要符号表 | 第14-15页 |
| 第1章 文献综述 | 第15-26页 |
| 1.1 CRISPR/Cas系统的发现史与其防御机制 | 第15-20页 |
| 1.1.1 CRISPR/Cas系统的发现历史 | 第15-16页 |
| 1.1.2 CRISPR/Cas系统的防御机制 | 第16-18页 |
| 1.1.3 CRISPR/Cas系统的分类 | 第18-19页 |
| 1.1.4 CRISPR/Cas9基因组编辑技术 | 第19-20页 |
| 1.2 Cas9核糖核蛋白复合复合物的应用 | 第20-21页 |
| 1.3 大规模制备Cas9 RNP的目的与意义 | 第21-22页 |
| 1.4 目前已有的DNA装配方法 | 第22-25页 |
| 1.5 建立基于Cas9-sgRNA复合物的克隆装配方法的目的与意义 | 第25-26页 |
| 第2章 材料与方法 | 第26-43页 |
| 2.1 材料 | 第26-35页 |
| 2.1.1 本实验所用菌株 | 第26页 |
| 2.1.2 本实验所用质粒 | 第26-27页 |
| 2.1.3 本实验所用试剂 | 第27页 |
| 2.1.4 本实验所用培养基配方 | 第27-28页 |
| 2.1.5 本实验所用溶液配方 | 第28-30页 |
| 2.1.6 本实验所用引物及模版 | 第30-35页 |
| 2.1.7 本实验所用仪器与设备 | 第35页 |
| 2.2 方法 | 第35-43页 |
| 2.2.1 PCR反应 | 第35-36页 |
| 2.2.2 琼脂糖凝胶电泳检测DNA | 第36-37页 |
| 2.2.3 omega试剂盒回收目的DNA | 第37页 |
| 2.2.4 碱裂解法质粒DNA的提取 | 第37-38页 |
| 2.2.5 omega试剂盒提取质粒DNA | 第38页 |
| 2.2.6 SDS-PAGE蛋白电泳 | 第38-40页 |
| 2.2.7 T5核酸外切酶介导的克隆装配 | 第40页 |
| 2.2.8 Cas9蛋白的表达纯化 | 第40-41页 |
| 2.2.9 Bradford法测定蛋白浓度 | 第41页 |
| 2.2.10 体外转录合成sgRNA | 第41-43页 |
| 第3章 结果与分析 | 第43-65页 |
| 3.1 SpCas9蛋白的表达和纯化、浓度的测定及其活性的检测 | 第43-46页 |
| 3.1.1 SpCas9蛋白在大肠杆菌的异源表达 | 第43页 |
| 3.1.2 SpCas9蛋白的纯化 | 第43-44页 |
| 3.1.3 SpCas9蛋白浓度的测定 | 第44页 |
| 3.1.4 SpCas9活性的检测 | 第44-46页 |
| 3.2 双质粒分别表达SpCas9和sgRNA | 第46-49页 |
| 3.2.1 构建pUC57K-sgccr5质粒的构建 | 第46-48页 |
| 3.2.2 Cas9表达质粒与sgRNA表达质粒共转化大肠杆菌,表达并纯化 | 第48-49页 |
| 3.3 单质粒共表达SpCas9和sgRNA | 第49-50页 |
| 3.3.1 共表达SpCas9和sgRNA质粒的构建 | 第49页 |
| 3.3.2 Ptac-cas9-T7sgRNA转化大肠杆菌表达并纯化复合物 | 第49-50页 |
| 3.4 SpCas9 RNP性质的探究 | 第50-52页 |
| 3.4.1 Cas9 RNP酶活的定义 | 第50-51页 |
| 3.4.2 SpCas9 RNP的稳定性 | 第51-52页 |
| 3.4.3 SpCas9 RNP酶切位点的测序 | 第52页 |
| 3.5 SpCas9 RNP用于常规的分子克隆实验 | 第52-55页 |
| 3.5.1 靶向pcDNA3.1和pET28a多克隆位点复合物表达质粒的构建 | 第53-54页 |
| 3.5.2 RNP对pcDNA3.1和pET28a多克隆位点的酶切,及其末端测序 | 第54-55页 |
| 3.6 建立基于SpCas9 RNP的装配方法 | 第55-65页 |
| 3.6.1 单个RNP介导的3片段克隆装配 | 第55-58页 |
| 3.6.2 4个SpCas9 RNPs介导的多片段循环装配 | 第58-65页 |
| 第4章 讨论与展望 | 第65-67页 |
| 参考文献 | 第67-72页 |
| 致谢 | 第72页 |
