| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 第一章 前言 | 第13-28页 |
| 1.1 淀粉 | 第13页 |
| 1.2 淀粉酶 | 第13-15页 |
| 1.2.1 淀粉酶分类 | 第14页 |
| 1.2.2 淀粉酶的结构及作用 | 第14-15页 |
| 1.3 α-淀粉酶概述 | 第15-17页 |
| 1.3.1 α-淀粉酶结构特点 | 第15-16页 |
| 1.3.2 α-淀粉酶的催化机理 | 第16-17页 |
| 1.3.3 α-淀粉酶的底物特异性 | 第17页 |
| 1.3.4 α-淀粉酶的应用 | 第17页 |
| 1.4 极端微生物 | 第17-19页 |
| 1.4.1 极端微生物分类 | 第18-19页 |
| 1.4.2 极端酶的应用 | 第19页 |
| 1.5 嗜盐微生物 | 第19-22页 |
| 1.5.1 嗜盐微生物分类 | 第20页 |
| 1.5.2 嗜盐机制 | 第20-22页 |
| 1.5.3 嗜盐酶 | 第22页 |
| 1.6 酶分子改造及研究进展 | 第22-26页 |
| 1.6.1 理性设计 | 第23页 |
| 1.6.2 非理性设计 | 第23-24页 |
| 1.6.3 半理性设计 | 第24-26页 |
| 1.7 立题依据及研究意义 | 第26-27页 |
| 1.8 实验技术路线 | 第27-28页 |
| 第二章 材料与方法 | 第28-46页 |
| 2.1 实验材料 | 第28页 |
| 2.1.1 菌种和质粒 | 第28页 |
| 2.1.2 试剂 | 第28页 |
| 2.1.3 酶制剂 | 第28页 |
| 2.1.4 培养基 | 第28页 |
| 2.1.5 仪器设备 | 第28页 |
| 2.2 实验方法与步骤 | 第28-38页 |
| 2.2.1 信号肽预测 | 第28-29页 |
| 2.2.2 重组质粒pSE380-k3的连接构建 | 第29-38页 |
| 2.3 K3分子改造 | 第38-42页 |
| 2.3.1 突变位点的选择 | 第38-39页 |
| 2.3.2 突变引物设计 | 第39-41页 |
| 2.3.3 突变子PCR扩增条件 | 第41-42页 |
| 2.3.4 突变子PCR产物纯化、酶切 | 第42页 |
| 2.3.5 突变子转化、筛选、验证 | 第42页 |
| 2.3.6 突变酶的诱导表达纯化 | 第42页 |
| 2.4 酶学性质测定 | 第42-46页 |
| 2.4.1 最适缓冲液测定 | 第42-43页 |
| 2.4.2 pH对酶活力的影响 | 第43页 |
| 2.4.3 pH对酶稳定性测定 | 第43页 |
| 2.4.4 温度对酶活力的影响 | 第43-44页 |
| 2.4.5 酶的温度热稳定性影响 | 第44页 |
| 2.4.6 最适NaCl测定 | 第44页 |
| 2.4.7 金属离子对酶的影响 | 第44页 |
| 2.4.8 CaCl_2对酶活力的影响 | 第44-45页 |
| 2.4.9 酶的Km和Vmax测定 | 第45-46页 |
| 第三章 结果与分析 | 第46-70页 |
| 3.1 嗜盐α-淀粉酶重组子构建 | 第46-49页 |
| 3.1.1 嗜盐α-淀粉酶信号肽预测 | 第46-47页 |
| 3.1.2 嗜盐α-淀粉酶K3基因的扩增 | 第47页 |
| 3.1.3 嗜盐α-淀粉酶重组子的双酶切验证 | 第47-48页 |
| 3.1.4 反向PCR扩增突变基因 | 第48-49页 |
| 3.2 嗜盐α-淀粉酶K3酶学性质测定 | 第49-57页 |
| 3.2.1 嗜盐α-淀粉酶K3的纯化 | 第49-50页 |
| 3.2.2 最适缓冲液测定 | 第50-51页 |
| 3.2.3 K3的最适pH测定 | 第51-52页 |
| 3.2.4 K3的pH稳定性 | 第52页 |
| 3.2.5 K3的最适温度测定 | 第52-53页 |
| 3.2.6 K3的温度热稳定性测定 | 第53-54页 |
| 3.2.7 金属离子对K3酶活性的影响 | 第54页 |
| 3.2.8 Ca~(2+)对酶活力的影响 | 第54-55页 |
| 3.2.9 NaCl盐浓度对K3淀粉酶的影响 | 第55-56页 |
| 3.2.10 K3的Km和Vmax测定 | 第56页 |
| 3.2.11 HPLC检测K3水解淀粉的产物 | 第56-57页 |
| 3.3 对K3进行定点突变 | 第57-65页 |
| 3.3.1 嗜盐α-淀粉酶K3-T329D的纯化 | 第59-60页 |
| 3.3.2 k3-T329D最适pH | 第60页 |
| 3.3.3 k3-T329D pH稳定性测定 | 第60-61页 |
| 3.3.4 K3-T329D最适温度测定 | 第61-62页 |
| 3.3.5 K3-T329D温度热稳定性测定 | 第62页 |
| 3.3.6 K3-T329D金属离子测定 | 第62-63页 |
| 3.3.7 Ca~(2+)对K3-T329D的影响 | 第63-64页 |
| 3.3.8 K3-329D最适NaCl测定 | 第64页 |
| 3.3.9 K3-T329D的Km和Vmax测定 | 第64-65页 |
| 3.4 K3-329位点饱和突变 | 第65-67页 |
| 3.4.1 其他嗜盐酶突变改造 | 第66-67页 |
| 3.5 结构分析 | 第67-70页 |
| 3.5.1 圆二色谱分析 | 第69-70页 |
| 第四章 讨论 | 第70-73页 |
| 4.1 嗜盐酶的应用研究 | 第70-71页 |
| 4.2 嗜盐酶的嗜盐机理研究 | 第71-73页 |
| 第五章 结论与展望 | 第73-76页 |
| 5.1 结论 | 第73-74页 |
| 5.2 展望 | 第74-76页 |
| 参考文献 | 第76-89页 |
| 附录1 | 第89-92页 |
| 附录2 | 第92-95页 |
| 附录3 | 第95页 |