| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 第一章 绪论 | 第18-30页 |
| 1.1 葡萄糖脱氢酶的发现和分布 | 第18页 |
| 1.1.1 葡萄糖脱氢酶的发现 | 第18页 |
| 1.1.2 葡萄糖脱氢酶的分布 | 第18页 |
| 1.2 葡萄糖脱氢酶的分类 | 第18-19页 |
| 1.2.1 NADP~+依赖的葡萄糖脱氢酶 | 第18-19页 |
| 1.2.2 PQQ依赖的葡萄糖脱氢酶 | 第19页 |
| 1.3 葡萄糖脱氢酶的生物学功能 | 第19-20页 |
| 1.3.1 生物领域 | 第19-20页 |
| 1.3.2 食品和医药领域 | 第20页 |
| 1.4 吡咯喹啉醌的发现和分布 | 第20-21页 |
| 1.4.1 吡咯喹啉醌的发现 | 第20-21页 |
| 1.4.2 吡咯喹啉醌的分布 | 第21页 |
| 1.5 吡咯喹啉醌的生物合成基因 | 第21-24页 |
| 1.5.1 吡咯喹啉醌产生菌的基因组成及同源性分析 | 第21-22页 |
| 1.5.2 pqqA | 第22-23页 |
| 1.5.3 pqqB | 第23页 |
| 1.5.4 pqqC | 第23页 |
| 1.5.5 pqqD和pqqE | 第23页 |
| 1.5.6 pqqF | 第23-24页 |
| 1.6 生物学功能 | 第24-27页 |
| 1.6.1 生物防治剂和植物生长促进因子 | 第24-25页 |
| 1.6.2 临床应用 | 第25-26页 |
| 1.6.3 信号转导中的应用 | 第26页 |
| 1.6.4 生物电子学领域的发展 | 第26-27页 |
| 1.7 PQQ的检测 | 第27页 |
| 1.7.1 酶法 | 第27页 |
| 1.7.2 高效液相色谱法 | 第27页 |
| 1.7.3 非酶法 | 第27页 |
| 1.8 本课题的研究意义 | 第27-30页 |
| 第二章 不同来源葡萄糖脱氢酶基因克隆表达 | 第30-48页 |
| 2.1 引言 | 第30页 |
| 2.2 实验材料 | 第30-31页 |
| 2.2.1 菌种和质粒 | 第30页 |
| 2.2.2 培养基 | 第30-31页 |
| 2.2.3 主要试剂 | 第31页 |
| 2.3 构建重组大肠杆菌 | 第31-34页 |
| 2.3.1 基因组的提取 | 第31页 |
| 2.3.2 扩增葡萄糖脱氢酶基因gdh | 第31-32页 |
| 2.3.3 构建pET28a-gdh载体 | 第32-33页 |
| 2.3.4 鉴定pET28a-gdh载体 | 第33-34页 |
| 2.3.5 构建工程菌 | 第34页 |
| 2.3.6 三株工程菌中gdh基因序列同源性比对 | 第34页 |
| 2.4 工程菌中gdh基因的表达 | 第34-35页 |
| 2.5 工程菌的发酵 | 第35-36页 |
| 2.5.1 测定工程菌生物量 | 第35页 |
| 2.5.2 绘制葡萄糖含量的标准曲线 | 第35页 |
| 2.5.3 测定工程菌的葡萄糖含量 | 第35页 |
| 2.5.4 绘制NADH标准曲线 | 第35-36页 |
| 2.5.5 测定工程菌的GDH蛋白质含量和酶的活性 | 第36页 |
| 2.6 结果与讨论 | 第36-47页 |
| 2.6.1 提质粒 | 第36页 |
| 2.6.2 提取基因组 | 第36-37页 |
| 2.6.3 扩增gdh基因片段 | 第37-38页 |
| 2.6.4 鉴定pET28a-gdh载体 | 第38-39页 |
| 2.6.5 构建BL21(pET28a-gdh)工程菌 | 第39-40页 |
| 2.6.6 工程菌中gdh基因的序列分析 | 第40页 |
| 2.6.7 工程菌中gdh基因的表达 | 第40-41页 |
| 2.6.8 测定工程菌的生物量 | 第41-42页 |
| 2.6.9 葡萄糖含量的标准曲线 | 第42页 |
| 2.6.10 测定工程菌中葡萄糖含量 | 第42-44页 |
| 2.6.11 NADH标准曲线 | 第44页 |
| 2.6.12 测定工程菌的GDH蛋白质含量和酶活性 | 第44-47页 |
| 2.7 本章小结 | 第47-48页 |
| 第三章 大肠杆菌葡萄糖脱氢酶基因的克隆与表达及PQQ检测 | 第48-64页 |
| 3.1 引言 | 第48页 |
| 3.2 实验材料 | 第48页 |
| 3.2.1 菌种和质粒 | 第48页 |
| 3.2.2 培养基 | 第48页 |
| 3.2.3 主要试剂 | 第48页 |
| 3.3 构建工程菌 | 第48-50页 |
| 3.3.1 扩增葡萄糖脱氢酶基因gdh | 第48-49页 |
| 3.3.2 构建pETpk-gdh载体 | 第49页 |
| 3.3.3 鉴定pETpk-gdh载体 | 第49页 |
| 3.3.4 构建工程菌 | 第49-50页 |
| 3.3.5 K. p(pETpk-gdh)中gdh基因序列同源性比对分析 | 第50页 |
| 3.4 工程菌gdh基因的表达 | 第50页 |
| 3.5 确定高效液相色谱检测PQQ的条件 | 第50-51页 |
| 3.5.1 排除高效液相色谱中各试剂组分的干扰 | 第50页 |
| 3.5.2 确定PQQ分析的最佳波长 | 第50-51页 |
| 3.5.3 确定PQQ分析的最佳流速 | 第51页 |
| 3.5.4 确定最佳配比 | 第51页 |
| 3.5.5 绘制PQQ标准曲线 | 第51页 |
| 3.6 工程菌的发酵 | 第51-52页 |
| 3.6.1 测定K.p(pETpk-gdh)工程菌的生物量 | 第51页 |
| 3.6.2 测定K.p(pETpk-gdh)工程菌中的葡萄糖含量 | 第51-52页 |
| 3.6.3 测定工程菌的GDH蛋白质含量和酶活性 | 第52页 |
| 3.6.4 工程菌的PQQ含量的测定 | 第52页 |
| 3.7 结果与讨论 | 第52-63页 |
| 3.7.1 提取K.pneumoniae(pETpk)质粒 | 第52-53页 |
| 3.7.2 扩增gdh基因片段 | 第53页 |
| 3.7.3 鉴定pETpk-gdh载体 | 第53-54页 |
| 3.7.4 构建K.p(pETpk-gdh)工程菌 | 第54页 |
| 3.7.5 工程菌中gdh基因的序列分析 | 第54-55页 |
| 3.7.6 工程菌gdh基因的表达 | 第55页 |
| 3.7.7 排除高效液相色谱中各试剂组分的干扰 | 第55-57页 |
| 3.7.8 确定PQQ分析的最佳波长 | 第57-58页 |
| 3.7.9 确定PQQ分析的最佳流速 | 第58页 |
| 3.7.10 确定最佳配比 | 第58-59页 |
| 3.7.11 绘制PQQ标准曲线 | 第59-60页 |
| 3.7.12 测定工程菌的生物量 | 第60-61页 |
| 3.7.13 测定工程菌中葡萄糖含量 | 第61-62页 |
| 3.7.14 测定工程菌的GDH蛋白质含量和酶活性 | 第62-63页 |
| 3.7.15 工程菌的PQQ含量的测定 | 第63页 |
| 3.8 本章小结 | 第63-64页 |
| 第四章 添加前体物对PQQ产量的影响 | 第64-80页 |
| 4.1 引言 | 第64页 |
| 4.2 实验材料 | 第64页 |
| 4.2.1 菌种 | 第64页 |
| 4.2.2 培养基 | 第64页 |
| 4.2.3 主要试剂 | 第64页 |
| 4.3 单因素实验 | 第64-67页 |
| 4.3.1 谷氨酸对PQQ产量的影响 | 第64-65页 |
| 4.3.2 酪氨酸对PQQ产量的影响 | 第65-66页 |
| 4.3.3 谷氨酸和酪氨酸混合物对PQQ产量的影响 | 第66-67页 |
| 4.4 正交实验 | 第67-68页 |
| 4.5 结果分析 | 第68-78页 |
| 4.5.1 谷氨酸对PQQ产量的影响 | 第68-70页 |
| 4.5.2 酪氨酸对PQQ产量的影响 | 第70-72页 |
| 4.5.3 谷氨酸和酪氨酸对PQQ产量的影响 | 第72-74页 |
| 4.5.4 正交实验 | 第74-78页 |
| 4.6 本章小结 | 第78-80页 |
| 第五章 结论 | 第80-82页 |
| 5.1 本课题主要结论 | 第80页 |
| 5.2 创新点 | 第80-81页 |
| 5.3 问题与建议 | 第81-82页 |
| 参考文献 | 第82-86页 |
| 附录1 仪器设备 | 第86-88页 |
| 附录2 试剂 | 第88-90页 |
| 附录3 试剂配制 | 第90-92页 |
| 致谢 | 第92-94页 |
| 研究成果及发表的学术论文 | 第94-96页 |
| 作者和导师简介 | 第96-98页 |
| 附件 | 第98-99页 |
