| 目录 | 第6-10页 |
| 摘要 | 第10-14页 |
| ABSTRACT | 第14-20页 |
| 第一部分 | 第21-60页 |
| 第一章 单核细胞增多性李斯特菌的毒力因子与感染机制 | 第22-41页 |
| 1. 单增李斯特菌概述 | 第22-25页 |
| 2. 单增李斯特菌胞内感染过程 | 第25-26页 |
| 3. 单增李斯特菌的毒力因子 | 第26-36页 |
| 3.1 黏附侵袭因子 | 第26-33页 |
| 3.2 胞内增殖与迁移因子 | 第33-36页 |
| 4. 单增李斯特菌的毒力调控因子 | 第36-41页 |
| 4.1 PrfA调控因子 | 第36-38页 |
| 4.2 SigB调控因子 | 第38-39页 |
| 4.3 双元调控系统 | 第39页 |
| 4.4 毒力调控相关的Small RNAs | 第39-41页 |
| 第二章 单核细胞增多性李斯特菌的抗酸应激作用 | 第41-60页 |
| 1. 酸耐受性应答反应(Acid tolerance response,ATR) | 第41-44页 |
| 2. 单增李斯特菌抗酸应激相关系统 | 第44-50页 |
| 2.1 谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)系统 | 第45-48页 |
| 2.2 FoF_1-ATPase | 第48-49页 |
| 2.3 其他酸应激相关机制或分子 | 第49-50页 |
| 3. 酸应激转录组与蛋白质组学研究 | 第50-52页 |
| 4. 抗酸应激调控机制 | 第52-56页 |
| 4.1 应激调控因子SigB(σ~B) | 第53-56页 |
| 4.2 双元调控系统LisRK | 第56页 |
| 5. 本研究目的 | 第56-60页 |
| 第二部分 | 第60-188页 |
| 第一章 单增李斯特菌不同菌株抗酸应激能力比较 | 第62-81页 |
| 第一节 单增李斯特菌不同菌株对有机酸和无机酸敏感性差异 | 第62-71页 |
| 摘要 | 第62-63页 |
| 1. 材料与方法 | 第63-65页 |
| 1.1 菌株及培养条件 | 第63页 |
| 1.2 主要试剂和仪器 | 第63页 |
| 1.3 生长曲线测定 | 第63-64页 |
| 1.4 致死性酸环境中存活率比较 | 第64-65页 |
| 2. 结果 | 第65-71页 |
| 2.1 pH 5.5和4.5酸环境中的生长能力比较 | 第65-70页 |
| 2.2 致死性酸应激下的存活能力比较 | 第70-71页 |
| 第二节 单增李斯特菌胞内pH的动态变化研究 | 第71-79页 |
| 摘要 | 第71-73页 |
| 1. 材料与方法 | 第73-74页 |
| 1.1 菌株及培养条件 | 第73页 |
| 1.2 主要试剂和仪器 | 第73页 |
| 1.3 细菌标记 | 第73页 |
| 1.4 细胞内pH(pH_i)标准曲线的建立 | 第73-74页 |
| 1.5 不同酸应激下的pH_i动态变化测定 | 第74页 |
| 2. 结果 | 第74-79页 |
| 2.1 pH_i与Ratio_(490/435)标准曲线 | 第74-75页 |
| 2.2 不同菌株在pH 3.5～5.5应激下的pH_i动态变化 | 第75-79页 |
| 第三节 讨论 | 第79-81页 |
| 1. 单增李斯特菌pH_i测定体系 | 第79页 |
| 2. 单增李斯特菌抗酸应激能力的菌株间差异性 | 第79-80页 |
| 3. 有机酸和无机酸的抑菌效应差异 | 第80-81页 |
| 第二章 单增李斯特菌精氨酸脱亚胺酶抗酸应激机制 | 第81-112页 |
| 第一节 单增李斯特菌精氨酸脱亚胺酶表达及抗体制备 | 第81-92页 |
| 摘要 | 第81-83页 |
| 1. 材料与方法 | 第83-87页 |
| 1.1 菌株及培养条件 | 第83页 |
| 1.2 质粒和主要试剂 | 第83页 |
| 1.3 生物信息学分析 | 第83-84页 |
| 1.4 重组表达质粒构建 | 第84页 |
| 1.5 重组ADI蛋白表达及多克隆抗体制备 | 第84-87页 |
| 2. 结果 | 第87-92页 |
| 2.1 不同细菌ADI基因和编码蛋白的生物信息学分析 | 第87-90页 |
| 2.2 重组质粒pET30a-ADI的鉴定 | 第90页 |
| 2.3 重组ADI蛋白表达纯化及抗体效价 | 第90-92页 |
| 第二节 单增李斯特菌精氨酸脱亚胺酶介导抗酸应激和毒力 | 第92-110页 |
| 摘要 | 第92-93页 |
| 1. 材料与方法 | 第93-104页 |
| 1.1 菌株、细胞及培养条件 | 第93页 |
| 1.2 质粒、主要试剂和仪器 | 第93-94页 |
| 1.3 arcA基因缺失株和回补株的构建 | 第94-97页 |
| 1.4 基因转录和蛋白表达水平变化分析 | 第97-100页 |
| 1.5 生长试验 | 第100页 |
| 1.6 人工胃液和小鼠胃内存活试验 | 第100-101页 |
| 1.7 全菌ADI活性分析 | 第101-102页 |
| 1.8 细菌胞内pH(pH_i)测定 | 第102-103页 |
| 1.9 细胞及小鼠脾脏内增殖试验 | 第103-104页 |
| 2. 结果 | 第104-110页 |
| 2.1 arcA基因缺失株和回补株的鉴定 | 第104-105页 |
| 2.2 酸应激后arcA基因转录和蛋白表达水平均显著上调 | 第105-106页 |
| 2.3 arcA介导细菌在酸性环境中的生长能力 | 第106页 |
| 2.4 arcA介导细菌在人工胃液和小鼠胃内的抗酸应激 | 第106-108页 |
| 2.5 arcA具备精氨酸脱亚胺酶活性 | 第108-109页 |
| 2.6 arcA不介导细菌在RAW264.7内增殖 | 第109页 |
| 2.7 arcA参与细菌在小鼠脾脏内的迁移和增殖 | 第109-110页 |
| 第三节 讨论 | 第110-112页 |
| 1. 单增李斯特菌精氨酸脱亚胺酶系统 | 第110页 |
| 2. 单增李斯特菌精氨酸脱亚胺酶与抗酸应激 | 第110-111页 |
| 3. 单增李斯特菌精氨酸脱亚胺酶与细菌致病力 | 第111-112页 |
| 第三章 单增李斯特菌鲜精胺脱亚胺酶抗酸应激机制 | 第112-156页 |
| 第一节 单增李斯特菌鲜精胺脱亚胺酶生物信息学分析及表达 | 第112-121页 |
| 摘要 | 第112-114页 |
| 1. 材料与方法 | 第114-116页 |
| 1.1 菌株及培养条件 | 第114页 |
| 1.2 质粒和主要试剂 | 第114页 |
| 1.3 生物信息学分析 | 第114-115页 |
| 1.4 重组表达质粒构建 | 第115页 |
| 1.5 重组AguA1和AguA2蛋白的表达 | 第115-116页 |
| 2. 结果 | 第116-121页 |
| 2.1 不同来源AgDI的生物信息学分析 | 第116-119页 |
| 2.2 重组AguA1和AguA2表达质粒的鉴定 | 第119-120页 |
| 2.3 重组AguA1和AguA2蛋白的表达与纯化 | 第120-121页 |
| 第二节 单增李斯特菌鲜精胺脱亚胺酶的抗酸应激功能 | 第121-127页 |
| 摘要 | 第121-122页 |
| 1. 材料与方法 | 第122-124页 |
| 1.1 菌株及培养条件 | 第122页 |
| 1.2 质粒、主要试剂和仪器 | 第122页 |
| 1.3 基因缺失株与回补株的构建 | 第122-123页 |
| 1.4 基因的转录水平变化 | 第123-124页 |
| 1.5 人工胃液和小鼠胃内存活试验 | 第124页 |
| 2. 结果 | 第124-127页 |
| 2.1 缺失株和回补株的鉴定 | 第124-125页 |
| 2.2 酸应激后aguA1和aguA2基因转录水平均显著上调 | 第125页 |
| 2.3 aguA1而非aguA2介导细菌在人工胃液和小鼠胃内抗酸应激 | 第125-127页 |
| 第三节 单增李斯特菌双拷贝鲱精胺脱亚胺酶的活性差异机制 | 第127-153页 |
| 摘要 | 第127-128页 |
| 1. 材料与方法 | 第128-137页 |
| 1.1 菌株及培养条件 | 第128页 |
| 1.2 质粒和主要试剂 | 第128-129页 |
| 1.3 重组AguA1和AguA2蛋白定点突变及其表达 | 第129-132页 |
| 1.4 AguA1和AguA2的活性比较 | 第132-133页 |
| 1.5 AguA1的酶活动力学分析 | 第133-135页 |
| 1.6 AguA1底物特异性分析 | 第135-136页 |
| 1.7 AguA1酶活性影响因素分析 | 第136-137页 |
| 1.8 AguA1和AguA2突变体蛋白的活性分析 | 第137页 |
| 2. 结果 | 第137-153页 |
| 2.1 AguA1和AguA2突变体蛋白的测序验证 | 第137页 |
| 2.2 AguA1和AguA2突变体蛋白的表达及纯化 | 第137-143页 |
| 2.3 AguA1而非AguA2具备鲱精胺脱亚胺酶活性 | 第143-144页 |
| 2.4 AguA1具备高底物特异性 | 第144-145页 |
| 2.5 AguA1具备最适反应温度和pH | 第145-146页 |
| 2.6 AguA1的酶活动力学参数 | 第146-147页 |
| 2.7 AguA1活性受金属离子和温度影响 | 第147-148页 |
| 2.8 AguA1和AguA2突变体蛋白的活性分析 | 第148-151页 |
| 2.9 AguA1的催化机理 | 第151-153页 |
| 第四节 讨论 | 第153-156页 |
| 1. 单增李斯特菌具备双拷贝鲱精胺脱亚胺酶 | 第153页 |
| 2. 单增李斯特菌AguA1和AguA2的抗酸应激差异机制 | 第153-156页 |
| 第四章 单增李斯特菌精氨酸抑制因子调控抗酸应激机制 | 第156-188页 |
| 第一节 单增李斯特菌精氨酸抑制因子及相关基因分析和表达 | 第156-167页 |
| 摘要 | 第156-158页 |
| 1. 材料与方法 | 第158-160页 |
| 1.1 菌株及培养条件 | 第158页 |
| 1.2 质粒和主要试剂 | 第158-159页 |
| 1.3 ArgR及其相关基因启动子区分析 | 第159页 |
| 1.4 重组表达质粒构建 | 第159-160页 |
| 1.5 重组蛋白表达纯化及多克隆抗体制备 | 第160页 |
| 1.6 重组ArgR蛋白多聚体分析 | 第160页 |
| 2. 结果 | 第160-167页 |
| 2.1 生物信息学结果 | 第160-164页 |
| 2.2 重组表达质粒的鉴定 | 第164-165页 |
| 2.3 重组ArgR、SigB和ArgG蛋白的表达与纯化 | 第165-167页 |
| 第二节 单增李斯特菌精氨酸抑制因子调控抗酸应激机制 | 第167-183页 |
| 摘要 | 第167-169页 |
| 1. 材料与方法 | 第169-173页 |
| 1.1 菌株及培养条件 | 第169页 |
| 1.2 质粒和主要试剂 | 第169页 |
| 1.3 基因缺失株和回补株的构建 | 第169-170页 |
| 1.4 重组ArgR蛋白的关键氨基酸位点突变及其表达 | 第170-171页 |
| 1.5 凝胶迁移阻滞试验(EMSA) | 第171-172页 |
| 1.6 gfp3报告载体的构建与分析 | 第172-173页 |
| 1.7 基因转录和蛋白表达水平分析 | 第173页 |
| 1.8 酸应激存活及巨噬细胞增殖 | 第173页 |
| 2. 结果 | 第173-183页 |
| 2.1 缺失株和回补株的鉴定 | 第173-174页 |
| 2.2 ArgR及其突变体蛋白与相关基因启动子的结合 | 第174-176页 |
| 2.3 ArgR对argG、arcA和sigB基因启动子强度的调控 | 第176-178页 |
| 2.4 ArgR调控argC、argG、arcA和sigB基因的转录 | 第178-179页 |
| 2.5 ArgR调控ArgG、ArcA和SigB蛋白的表达 | 第179-181页 |
| 2.6 ArgR影响细菌的酸应激存活能力 | 第181页 |
| 2.7 ArgR影响细菌在RAW264.7内的增殖能力 | 第181-183页 |
| 第三节 讨论 | 第183-188页 |
| 1. 单增李斯特菌ArgR具备该家族调控因子特性 | 第183页 |
| 2. 单增李斯特菌ArgR调控抗酸应激机制 | 第183-188页 |
| 全文结论 | 第188-190页 |
| 创新点 | 第190-192页 |
| 展望 | 第192-194页 |
| 参考文献 | 第194-216页 |
| 主要名词缩写 | 第216-218页 |
| 作者简介 | 第218-220页 |
| 攻读博士期间的科研成果 | 第220-222页 |
| 致谢 | 第222-223页 |
