| 摘要 | 第10-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-38页 |
| 1 微生物脂肪酶的研究进展 | 第13-24页 |
| 1.1 微生物脂肪酶的结构 | 第13-15页 |
| 1.2 微生物脂肪酶的理化性质 | 第15-16页 |
| 1.3 微生物脂肪酶的催化特性 | 第16-17页 |
| 1.4 微生物脂肪酶 | 第17-18页 |
| 1.5 微生物脂肪酶产生菌筛选方法 | 第18-19页 |
| 1.6 微生物脂肪酶的表达 | 第19-20页 |
| 1.7 微生物脂肪酶活力测定方法 | 第20-21页 |
| 1.8 微生物脂肪酶在工业中的应用 | 第21-24页 |
| 1.8.1 脂肪酶在食品工业中的应用 | 第21-22页 |
| 1.8.2 脂肪酶在洗涤剂行业的应用 | 第22页 |
| 1.8.3 脂肪酶在医学中的应用 | 第22-23页 |
| 1.8.4 脂肪酶在纺织工业中的应用 | 第23-24页 |
| 1.8.5 脂肪酶在生物柴油合成中的应用 | 第24页 |
| 2 微生物脂肪酶的定向进化 | 第24-34页 |
| 2.1 突变体文库的构建 | 第25-29页 |
| 2.2 定向进化文库的筛选策略 | 第29-31页 |
| 2.2.1 表型观察选择和筛选 | 第29页 |
| 2.2.2 微孔板筛选法 | 第29-30页 |
| 2.2.3 法噬菌体表面展示法 | 第30页 |
| 2.2.4 细胞表面展示 | 第30-31页 |
| 2.2.5 核糖体展示技术 | 第31页 |
| 2.3 定向进化在酶改造中的应用 | 第31-34页 |
| 2.3.1 提高脂肪酶的催化活性 | 第31-32页 |
| 2.3.2 提高脂肪酶的稳定性 | 第32页 |
| 2.3.3 提高脂肪酶的底物特异性 | 第32页 |
| 2.3.4 改变脂肪酶的对映异构体特异性 | 第32-34页 |
| 3 选题的目的意义、研究内容、技术路线 | 第34-38页 |
| 3.1 选题的目的意义 | 第34-35页 |
| 3.2 研究内容 | 第35-36页 |
| 3.3 技术路线 | 第36-38页 |
| 第二章 嗜热子囊菌光孢变种脂肪酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达 | 第38-90页 |
| 1 材料与方法 | 第38-59页 |
| 1.1 材料 | 第38-42页 |
| 1.1.1 供试菌株 | 第38页 |
| 1.1.2 质粒 | 第38页 |
| 1.1.3 酶和生化试剂 | 第38-39页 |
| 1.1.4 仪器 | 第39页 |
| 1.1.5 溶液配制 | 第39-41页 |
| 1.1.6 培养基配制 | 第41-42页 |
| 1.2 嗜热子囊菌光孢变种脂肪酶基因的克隆及其序列分析 | 第42-49页 |
| 1.2.1 引物设计 | 第42-43页 |
| 1.2.2 总RNA的提取(Trizol法) | 第43-44页 |
| 1.2.3 反转录cDNA第一链的合成 | 第44页 |
| 1.2.4 目的基因cDNA中间片段的分离 | 第44-46页 |
| 1.2.5 目的基因cDNA 3’端的分离及测序 | 第46-47页 |
| 1.2.6 目的基因5’末端TAIL-PCR扩增 | 第47-48页 |
| 1.2.7 目的基因全长cDNA和DNA序列的克隆 | 第48-49页 |
| 1.3 嗜热子囊菌光孢变种脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第49-55页 |
| 1.3.1 脂肪酶基因1g成熟肽序列的分离 | 第49-50页 |
| 1.3.2 酵母表达载体的构建 | 第50-51页 |
| 1.3.3 线性化质粒质粒的制备 | 第51页 |
| 1.3.4 酵母转化 | 第51-52页 |
| 1.3.5 酵母转化子的筛选与鉴定 | 第52-53页 |
| 1.3.6 酵母工程菌的培养和LG的诱导分泌表达 | 第53-54页 |
| 1.3.7 表达产物的生物学活性检测 | 第54-55页 |
| 1.3.8 表达产物LG的SDS-PAGE分析 | 第55页 |
| 1.3.9 脂肪酶工程菌产酶曲线及生长曲线的测定 | 第55页 |
| 1.4 重组脂肪酶的纯化 | 第55-56页 |
| 1.4.1 发酵液的硫酸铵沉淀 | 第55-56页 |
| 1.4.2 DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析 | 第56页 |
| 1.5 脂肪酶LG的活性电泳和糖染色 | 第56页 |
| 1.6 脂肪酶LG的Western-blot分析 | 第56-57页 |
| 1.7 重组表达脂肪酶酶学特性的研究 | 第57-59页 |
| 1.7.1 脂肪酶LG的最适反应温度 | 第57页 |
| 1.7.2 脂肪酶LG的最适反应pH值 | 第57-58页 |
| 1.7.3 脂肪酶LG的热稳定性 | 第58页 |
| 1.7.4 脂肪酶LG的pH稳定性 | 第58页 |
| 1.7.5 各种金属离子对脂肪酶活性的影响 | 第58页 |
| 1.7.6 脂肪酶LG的底物特异性 | 第58-59页 |
| 2 结果与分析 | 第59-85页 |
| 2.1 嗜热子囊菌光孢变种脂肪酶基因的克隆及其序列分析 | 第59-63页 |
| 2.1.1 T.aurantiacus var.levisporus总RNA的提取 | 第59页 |
| 2.1.2 T.aurantiacus var.levisporus基因组DNA的提取 | 第59-60页 |
| 2.1.3 脂肪酶基因中间片段的分离 | 第60页 |
| 2.1.4 脂肪酶基因cDNA 3’-末端的分离 | 第60-61页 |
| 2.1.5 脂肪酶基因DNA序列5’-末端的分离 | 第61-62页 |
| 2.1.6 脂肪酶基因全长序列的验证 | 第62-63页 |
| 2.2 脂肪酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析 | 第63-70页 |
| 2.2.1 脂肪酶基因的核苷酸序列及推测的相应氨基酸序列 | 第63-64页 |
| 2.2.2 脂肪酶基因1g的核苷酸序列分析 | 第64-65页 |
| 2.2.3 脂肪酶基因1g的氨基酸序列分析 | 第65-68页 |
| 2.2.4 脂肪酶基因1g的立体结构预测 | 第68页 |
| 2.2.5 脂肪酶基因1g的氨基酸序列同源性比较 | 第68-70页 |
| 2.3 脂肪酶基因1g在毕赤酵母中的表达 | 第70-81页 |
| 2.3.1 脂肪酶基因1g成熟肽序列的扩增 | 第70-71页 |
| 2.3.3 酵母表达载体的构建和鉴定 | 第71-74页 |
| 2.3.4 重组酵母转化子的筛选 | 第74-77页 |
| 2.3.5 脂肪酶基因1g在毕赤酵母中的高效表达及表达产物的检测 | 第77-81页 |
| 2.4 脂肪酶LG酶学性质研究 | 第81-85页 |
| 2.4.1 脂肪酶LG酵母工程菌的遗传稳定性分析 | 第81页 |
| 2.4.2 脂肪酶LG的最适反应温度 | 第81-82页 |
| 2.4.3 脂肪酶LG的最适反应pH值 | 第82页 |
| 2.4.4 脂肪酶LG的热稳定性 | 第82-83页 |
| 2.4.5 脂肪酶LG的pH稳定性 | 第83页 |
| 2.4.6 金属离子对表达脂肪酶LG活性的影响 | 第83-84页 |
| 2.4.7 表达脂肪酶LG的底物特异性 | 第84-85页 |
| 3 讨论 | 第85-90页 |
| 第三章 嗜热真菌脂肪酶的定向进化 | 第90-116页 |
| 1 材料与方法 | 第90-93页 |
| 1.1 材料 | 第90-91页 |
| 1.1.1 供试菌株 | 第90-91页 |
| 1.2 实验方法 | 第91-93页 |
| 1.2.1 易错PCR | 第91页 |
| 1.2.2. 易错PCR产物回收 | 第91页 |
| 1.2.3 突变体库的构建 | 第91-92页 |
| 1.2.4 突变体库的筛选方法 | 第92-93页 |
| 1.2.5 突变体序列的测定 | 第93页 |
| 1.2.6 突变脂肪酶工程菌酶活的测定 | 第93页 |
| 1.2.7 突变脂肪酶蛋白结构分析 | 第93页 |
| 2 结果与分析 | 第93-112页 |
| 2.1 嗜热子囊菌光孢变种脂肪酶LG的定向进化 | 第93-97页 |
| 2.1.1 易错PCR条件摸索 | 第93-94页 |
| 2.1.2 构建突变体库 | 第94-96页 |
| 2.1.3 酵母突变转化子的筛选 | 第96页 |
| 2.1.4 突变体库的复筛 | 第96-97页 |
| 2.2 疏绵状嗜热丝胞菌脂肪酶LN的定向进化 | 第97-112页 |
| 2.2.1 疏棉状嗜热丝孢菌T.lanuginosus总RNA的提取 | 第97页 |
| 2.2.2 脂肪酶ln基因的PCR扩增 | 第97-98页 |
| 2.2.3 脂肪酶基因ln在毕赤酵母中的表达 | 第98-99页 |
| 2.2.4 突变体库的构建 | 第99-100页 |
| 2.2.5 酵母突变转化子的筛选 | 第100-101页 |
| 2.2.6 突变体库的复筛 | 第101-102页 |
| 2.2.7 突变体酵母工程菌GS-LN4和GS-LN11的序列测定 | 第102-103页 |
| 2.2.8 GS-LN4和GS-LN11表达产物的纯化与酶学性质 | 第103-105页 |
| 2.2.9 工程菌GS-LN4和GS-LN11表达产物的改变的酶学性质 | 第105-107页 |
| 2.2.10 GS-LN4和GS-LN11脂肪酶蛋白结构分析 | 第107-108页 |
| 2.2.11 推测突变脂肪酶性质改变的可能机制 | 第108-112页 |
| 3. 讨论 | 第112-116页 |
| 结论 | 第116-118页 |
| 1.嗜热子囊菌光孢变种脂肪酶的克隆与表达 | 第116页 |
| 2.嗜热真菌脂肪酶的定向进化 | 第116-118页 |
| 参考文献 | 第118-134页 |
| 致谢 | 第134-135页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第135页 |
