| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 目录 | 第9-13页 |
| 第一章 前言 | 第13-27页 |
| 1.1 海藻糖和海藻酮糖 | 第13-19页 |
| 1.1.1 海藻糖和海藻酮糖的分布 | 第13-14页 |
| 1.1.2 海藻糖与海藻酮糖的理化性质及生物功能 | 第14-15页 |
| 1.1.3 海藻糖与海藻酮糖的应用前景 | 第15-17页 |
| 1.1.3.1 在食品方面的应用 | 第16页 |
| 1.1.3.2 在农业方面的应用 | 第16页 |
| 1.1.3.3 在医药方面的应用 | 第16页 |
| 1.1.3.4 在化妆品方面的应用 | 第16页 |
| 1.1.3.5 在保健品方面的应用 | 第16-17页 |
| 1.1.4 海藻糖与海藻酮糖的制备方法和研究进展 | 第17-19页 |
| 1.2 海藻糖合成酶 | 第19-25页 |
| 1.2.1 海藻糖合成酶的发现 | 第19-21页 |
| 1.2.2 海藻糖合成酶的结构和反应特点 | 第21-23页 |
| 1.2.3 海藻糖合成酶的发展前景 | 第23页 |
| 1.2.4 酶分子改造的研究进展 | 第23-25页 |
| 1.3 立题的依据和意义 | 第25-26页 |
| 1.4 技术路线 | 第26-27页 |
| 第二章 材料与方法 | 第27-36页 |
| 2.1 材料 | 第27页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第27页 |
| 2.1.2 主要酶和化学试剂 | 第27页 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 | 第27页 |
| 2.1.4 培养基 | 第27页 |
| 2.2 实验方法和步骤 | 第27-36页 |
| 2.2.1 Thermus ruber海藻糖合成酶基因的克隆 | 第28-29页 |
| 2.2.1.1 Thermus ruber海藻糖合成酶基因的序列分析 | 第28页 |
| 2.2.1.2 信号肽预测 | 第28页 |
| 2.2.1.3 引物设计 | 第28页 |
| 2.2.1.4 目的基因TR-TreS的PCR扩增 | 第28-29页 |
| 2.2.2 重组质粒的构建 | 第29-30页 |
| 2.2.2.1 酶切处理 | 第29页 |
| 2.2.2.2 连接 | 第29-30页 |
| 2.2.3 连接产物的转化 | 第30页 |
| 2.2.3.1 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第30页 |
| 2.2.3.2 重组质粒的转化 | 第30页 |
| 2.2.4 重组质粒的验证 | 第30页 |
| 2.2.5 TR-TreS的诱导表达 | 第30页 |
| 2.2.6 TR-TreS的纯化 | 第30-31页 |
| 2.2.6.1 粗酶液的制备 | 第30页 |
| 2.2.6.2 表达产物的纯化 | 第30-31页 |
| 2.2.7 TR-TreS目的蛋白的SDS-PAGE检测 | 第31页 |
| 2.2.8 TR-TreS蛋白含量的测定和蛋白标准曲线的绘制 | 第31-32页 |
| 2.2.9 海藻糖标准曲线的制作 | 第32-33页 |
| 2.2.10 HPLC对TR-TreS酶解产物的分析 | 第33页 |
| 2.2.11 TR-TreS酶学性质的研究 | 第33页 |
| 2.2.12 TR-TreS酶活力的测定 | 第33页 |
| 2.2.13 TR-TreS的同源建模及保守氨基酸序列分析 | 第33页 |
| 2.2.14 TR-TreS的分子改造 | 第33页 |
| 2.2.15 引物设计 | 第33-35页 |
| 2.2.16 构建突变子 | 第35页 |
| 2.2.17 HPLC对突变酶Y205L酶解产物的分析 | 第35页 |
| 2.2.18 突变酶Y205L的酶学性质研究 | 第35页 |
| 2.2.19 突变酶Y205L的酶活力的测定 | 第35-36页 |
| 第三章 结果与分析 | 第36-67页 |
| 3.1 TR-TreS基因的克隆和表达 | 第36-41页 |
| 3.1.1 TR-TreS基因序列的分析 | 第36页 |
| 3.1.2 TR-TreS信号肽的预测 | 第36-37页 |
| 3.1.3 TR-TreS基因的克隆 | 第37-38页 |
| 3.1.4 重组质粒pSE380-TR-TreS的验证 | 第38-40页 |
| 3.1.4.1 重组子验证 | 第38-39页 |
| 3.1.4.2 PCR验证 | 第39页 |
| 3.1.4.3 双酶切验证 | 第39-40页 |
| 3.1.5 TR-TreS基因的表达、纯化及SDS-PAGE分析 | 第40-41页 |
| 3.2 TR-TreS的酶学性质研究 | 第41-57页 |
| 3.2.1 以麦芽糖为底物研究TR-TreS的酶学性质 | 第41-49页 |
| 3.2.1.1 HPLC对TR-TreS转化麦芽糖产物的分析 | 第41-42页 |
| 3.2.1.2 TR-TreS的最适pH | 第42-43页 |
| 3.2.1.3 TR-TreS的最适温度 | 第43-44页 |
| 3.2.1.4 TR-TreS的pH稳定性 | 第44页 |
| 3.2.1.5 TR-TreS的温度稳定性 | 第44-45页 |
| 3.2.1.6 金属离子对TR-TreS酶活力的影响 | 第45-46页 |
| 3.2.1.7 化学试剂对TR-TreS酶活力的影响 | 第46-47页 |
| 3.2.1.8 不同反应时间TR-TreS对产物中各糖变化的影响 | 第47页 |
| 3.2.1.9 不同温度TR-TreS对产物中各糖变化的影响 | 第47-48页 |
| 3.2.1.10 底物特异性研究 | 第48-49页 |
| 3.2.2 以蔗糖为底物深入研究TR-TreS的酶学性质 | 第49-57页 |
| 3.2.2.1 HPLC对TR-TreS转化蔗糖产物的分析 | 第49页 |
| 3.2.2.2 TR-TreS的最适pH | 第49-50页 |
| 3.2.2.3 TR-TreS的最适温度 | 第50-51页 |
| 3.2.2.4 TR-TreS的pH稳定性 | 第51页 |
| 3.2.2.5 TR-TreS的温度稳定性 | 第51-52页 |
| 3.2.2.6 金属离子对TR-TreS酶活力的影响 | 第52-53页 |
| 3.2.2.7 化学试剂对TR-TreS酶活力的影响 | 第53-54页 |
| 3.2.2.8 4℃冷藏对TR-TreS酶活的影响 | 第54页 |
| 3.2.2.9 不同反应时间TR-TreS对产物中各糖变化的影响 | 第54-55页 |
| 3.2.2.10 不同温度TR-TreS对产物中各糖变化的影响 | 第55-56页 |
| 3.2.2.11 TR-TreS比活力的测定 | 第56-57页 |
| 3.3 海藻糖合成酶的分子改造 | 第57-67页 |
| 3.3.1 TR-TreS的三维结构模型及保守氨基酸序列分析 | 第57-58页 |
| 3.3.2 突变位点的选择 | 第58-59页 |
| 3.3.3 饱和突变位点的选择 | 第59-60页 |
| 3.3.4 Y205L的表达、纯化及SDS-PAGE分析 | 第60页 |
| 3.3.5 Y205L突变酶的酶学性质研究 | 第60-66页 |
| 3.3.5.1 HPLC对Y205L转化麦芽糖产物的分析 | 第60-61页 |
| 3.3.5.2 Y205L的最适pH | 第61-62页 |
| 3.3.5.3 Y205L的最适温度 | 第62-63页 |
| 3.3.5.4 Y205L的pH稳定性 | 第63页 |
| 3.3.5.5 Y205L的温度稳定性 | 第63-64页 |
| 3.3.5.6 金属离子对Y205L酶活力的影响 | 第64-65页 |
| 3.3.5.7 不同反应时间Y205L对产物中各糖变化的影响 | 第65页 |
| 3.3.5.8 不同温度Y205L对产物中各糖变化的影响 | 第65-66页 |
| 3.3.6 Y205L比活力的测定 | 第66-67页 |
| 第四章 讨论 | 第67-72页 |
| 4.1 海藻糖合成酶的分布及基因克隆表达 | 第67-68页 |
| 4.2 海藻糖合成酶的保守结构分析 | 第68-69页 |
| 4.3 海藻糖合成酶的酶学性质研究 | 第69-70页 |
| 4.4 TR-TreS的Km值和Vmax的测定 | 第70页 |
| 4.5 TR-TreS的SDS-PAGE分析 | 第70-72页 |
| 第五章 结论与展望 | 第72-75页 |
| 5.1 结论 | 第72-73页 |
| 5.2 问题和展望 | 第73-75页 |
| 参考文献 | 第75-86页 |
| 附录1 | 第86-90页 |
| 附录2 | 第90-93页 |
| 附录3 | 第93-94页 |
| 致谢 | 第94-95页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录 | 第95页 |
