| 摘要 | 第7-10页 |
| ABSTRACT | 第10-12页 |
| 符号与缩略语说明 | 第13-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-28页 |
| 1. 巴斯德毕赤酵母表达系统的启动子 | 第14-15页 |
| 2. 巴斯德毕赤酵母表达系统的信号肽 | 第15-16页 |
| 3. 表达宿主的构建 | 第16-17页 |
| 4. 表达载体组成 | 第17-18页 |
| 5. 构建外源蛋白表达菌株 | 第18-20页 |
| 6. 已在巴斯德毕赤酵母中高效表达的外源蛋白 | 第20-21页 |
| 7. 最新进展—巴斯德毕赤酵母糖基工程化菌株 | 第21-23页 |
| 8. 结语 | 第23页 |
| 参考文献 | 第23-28页 |
| 第二章 FLD1启动子驱动MPH在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达 | 第28-44页 |
| 1. 材料与方法 | 第29-34页 |
| 1.1 菌株、质粒、引物合成及DNA测序 | 第29页 |
| 1.2 培养基及培养条件 | 第29-30页 |
| 1.3 酶、抗生素、化学试剂和分子操作试剂盒 | 第30页 |
| 1.4 大肠杆菌一步法感受态的制备及转化 | 第30-31页 |
| 1.5 融合PCR步骤 | 第31页 |
| 1.6 DNA平末端加腺嘌呤碱基反应 | 第31页 |
| 1.7 插入片段和载体的酶连反应 | 第31页 |
| 1.8 质粒DNA的小量提取 | 第31-32页 |
| 1.9 质粒DNA的小量酶切 | 第32页 |
| 1.10 巴斯德毕赤酵母感受态细胞的制备及电转化 | 第32-33页 |
| 1.11 巴斯德毕赤酵母转化子验证 | 第33页 |
| 1.12 重组毕赤酵母菌株的摇瓶发酵试验 | 第33页 |
| 1.13 甲基对硫磷水解酶(MPH)酶活力测定方法 | 第33-34页 |
| 2. 结果与分析 | 第34-41页 |
| 2.1 FLD1启动子片段和α信号肽序列的扩增及融合 | 第34-37页 |
| 2.2 构建pEFαA酵母表达载体 | 第37-38页 |
| 2.3 构建pEFαA-smpd表达载体 | 第38-40页 |
| 2.4 重组毕赤酵母转化子筛选及鉴定 | 第40页 |
| 2.5 筛选MPH表达量高的酵母转化子 | 第40-41页 |
| 3. 本章小结 | 第41-42页 |
| 参考文献 | 第42-44页 |
| 第三章 去除Kex2蛋白酶切割位点对MPH表达的影响 | 第44-58页 |
| 1. 材料和方法 | 第46-48页 |
| 1.1 菌株、质粒、引物合成及DNA测序 | 第46页 |
| 1.2 培养基及培养条件 | 第46-47页 |
| 1.3 酶、抗生素、化学试剂及分子操作试剂盒 | 第47页 |
| 1.4 感受态细胞制备、转化和常规分子操作 | 第47页 |
| 1.5 DNA片段末端添加磷酸基团反应 | 第47-48页 |
| 1.6 重组毕赤酵母的摇瓶发酵试验及MPH酶活力测定 | 第48页 |
| 1.7 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析 | 第48页 |
| 2. 结果和分析 | 第48-54页 |
| 2.1 突变氨基酸的选择 | 第48-50页 |
| 2.2 定点突变策略 | 第50页 |
| 2.3 定点突变结果 | 第50-52页 |
| 2.4 构建pEFαA-smpdK和pEFαA-smpdQ表达质粒 | 第52页 |
| 2.5 重组毕赤酵母转化子的筛选及鉴定 | 第52-53页 |
| 2.6 去除Kex2蛋白酶切割位点后对MPH表达的影响 | 第53-54页 |
| 3. 本章小结 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-58页 |
| 第四章 基因剂量对MPH表达的影响 | 第58-66页 |
| 1. 材料与方法 | 第59-60页 |
| 1.1 菌株、质粒、引物合成及DNA测序 | 第59页 |
| 1.2 培养基及培养条件 | 第59-60页 |
| 1.3 酶、抗生素、化学试剂及分子操作试剂盒 | 第60页 |
| 1.4 感受态细胞制备、转化和常规分子操作 | 第60页 |
| 1.5 巴斯德毕赤酵母转化子验证、摇瓶表达、MPH酶活力测定 | 第60页 |
| 2. 结果和分析 | 第60-63页 |
| 2.1 构建p9KFLD-smpdK表达质粒 | 第60-61页 |
| 2.2 巴斯德毕赤酵母转化菌株的筛选 | 第61-62页 |
| 2.3 高拷贝重组菌株的筛选及验证 | 第62-63页 |
| 2.4 高拷贝重组菌株的摇瓶表达试验 | 第63页 |
| 3 本章小结 | 第63页 |
| 参考文献 | 第63-66页 |
| 第五章 巴斯德毕赤酵母遗传操作体系的研究 | 第66-86页 |
| 第一节 一种高效巴斯德毕赤酵母无标记基因删除方法 | 第66-78页 |
| 1 材料和方法 | 第68-71页 |
| 1.1 菌株、质粒、引物和DNA测序 | 第68-69页 |
| 1.2 培养基和培养条件 | 第69页 |
| 1.3 构建LCZL基因删除盒 | 第69-71页 |
| 1.4 融合LCZL片段和两侧的同源臂 | 第71页 |
| 1.5 巴斯德毕赤酵母感受态细胞的制备及电转化 | 第71页 |
| 2. 结果与分析 | 第71-75页 |
| 2.1 无标记基因删除系统的策略 | 第71-72页 |
| 2.2 HIS4基因无标记删除 | 第72-74页 |
| 2.3 PEP4基因无标记删除 | 第74页 |
| 2.4 产生双基因删除突变子 | 第74-75页 |
| 3. 讨论 | 第75-78页 |
| 第二节 巴斯德毕赤酵母的转化研究 | 第78-82页 |
| 1. 材料和方法 | 第78-79页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第78-79页 |
| 1.2 培养基及培养条件 | 第79页 |
| 1.3 酶、抗生素和化学试剂及分子操作试剂盒 | 第79页 |
| 1.4 分子操作 | 第79页 |
| 2. 结果及分析 | 第79-81页 |
| 2.1 pEFαA-2smpdK质粒的构建 | 第80页 |
| 2.2 环状质粒转化巴斯德毕赤酵母的研究 | 第80页 |
| 2.3 巴斯德毕赤酵母感受态细胞转化效率和储存时间的关系 | 第80-81页 |
| 3 本章小结 | 第81-82页 |
| 参考文献 | 第82-86页 |
| 全文总结 | 第86-88页 |
| 附录 | 第88-98页 |
| 附录1 实验用培养基及分子生物学试剂 | 第88-90页 |
| 附录2 巴斯德毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制 | 第90-91页 |
| 附录3 感受态细胞制备及转化所用试剂 | 第91-92页 |
| 附录4 甲基对硫磷酶活测定所用仪器及试剂 | 第92-93页 |
| 附录5 相关基因及载体序列 | 第93-98页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第98-100页 |
| 致谢 | 第100页 |
