| 摘要 | 第4-7页 |
| ABSTRACT | 第7-9页 |
| 第一章 前言 | 第14-36页 |
| 1.1 果聚糖 | 第14-23页 |
| 1.1.1 果聚糖分类及其性质 | 第14-15页 |
| 1.1.2 菊糖 | 第15页 |
| 1.1.3 左聚糖 | 第15-17页 |
| 1.1.4 果聚糖的功能及应用 | 第17-19页 |
| 1.1.4.1 医学应用 | 第17-18页 |
| 1.1.4.2 食品工业应用 | 第18页 |
| 1.1.4.3 化妆品行业应用 | 第18-19页 |
| 1.1.4.4 制药工业应用 | 第19页 |
| 1.1.4.5 农牧业应用 | 第19页 |
| 1.1.4.6 其他应用 | 第19页 |
| 1.1.5 左聚糖的生产 | 第19-23页 |
| 1.1.5.1 酶法生产左聚糖 | 第20-21页 |
| 1.1.5.2 发酵法生产左聚糖 | 第21-23页 |
| 1.2 蔗糖资源及其利用 | 第23-24页 |
| 1.3 与蔗糖利用有关的酶 | 第24-35页 |
| 1.3.1 蔗糖转化酶 | 第24-25页 |
| 1.3.2 蔗糖磷酸化酶 | 第25页 |
| 1.3.3 左聚糖蔗糖酶 | 第25-35页 |
| 1.3.3.1 左聚糖蔗糖酶及其催化反应 | 第25-26页 |
| 1.3.3.2 已知左聚糖蔗糖酶的三维结构和功能分析 | 第26-32页 |
| 1.3.3.3 不同来源的左聚糖蔗糖酶及其产左聚糖的概况 | 第32-35页 |
| 1.4 本课题研究的目的和意义 | 第35-36页 |
| 第二章 材料与方法 | 第36-60页 |
| 2.1 材料 | 第36-38页 |
| 2.1.1 菌株 | 第36页 |
| 2.1.2 化学试剂和酶制剂 | 第36-37页 |
| 2.1.3 PCR引物及测序 | 第37页 |
| 2.1.4 质粒 | 第37-38页 |
| 2.1.5 主要仪器设备 | 第38页 |
| 2.1.6 主要缓冲液和试剂溶液 | 第38页 |
| 2.1.7 培养基 | 第38页 |
| 2.1.7.1 苯胺兰高糖平板培养基(HSAB) | 第38页 |
| 2.1.7.2 其他培养基 | 第38页 |
| 2.2 方法 | 第38-60页 |
| 2.2.1 一般方法 | 第38-47页 |
| 2.2.1.1 大肠杆菌的培养 | 第38-39页 |
| 2.2.1.2 嗜热细菌的培养 | 第39页 |
| 2.2.1.3 采集微生物样品及分离 | 第39页 |
| 2.2.1.4 菌种保藏 | 第39页 |
| 2.2.1.5 细菌基因组总DNA提取 | 第39-40页 |
| 2.2.1.6 质粒提取 | 第40-41页 |
| 2.2.1.7 目的DNA片段的回收和纯化 | 第41-42页 |
| 2.2.1.8 大肠杆菌化学法感受态的制备 | 第42页 |
| 2.2.1.9 DNA酶切与连接 | 第42页 |
| 2.2.1.10 化学法转化 | 第42-43页 |
| 2.2.1.11 阳性克隆重组子的筛选和酶切验证 | 第43页 |
| 2.2.1.12 重组子质粒的验证 | 第43页 |
| 2.2.1.13 大肠杆菌重组蛋白粗酶的提取 | 第43-44页 |
| 2.2.1.14 重组蛋白表达产物的SDS-PAGE电泳 | 第44页 |
| 2.2.1.15 金属镍亲和层析纯化酶 | 第44-45页 |
| 2.2.1.16 细菌的16SrDNA克隆及测序 | 第45页 |
| 2.2.1.17 蛋白质含量标准曲线制作 | 第45-46页 |
| 2.2.1.18 葡萄糖标准曲线的制作 | 第46-47页 |
| 2.2.2 左聚糖蔗糖酶基因克隆及表达载体构建 | 第47-55页 |
| 2.2.2.1 SacB基因克隆 | 第47页 |
| 2.2.2.2 PCR扩增方法 | 第47-48页 |
| 2.2.2.3 表达载体构建 | 第48-51页 |
| 2.2.2.4 外源基因片段的诱导表达 | 第51页 |
| 2.2.2.5 重组左聚糖蔗糖酶的纯化 | 第51页 |
| 2.2.2.6 左聚糖蔗糖酶水解活力的测定 | 第51-52页 |
| 2.2.2.7 左聚糖蔗糖酶水解活力的酶学性质测定 | 第52-53页 |
| 2.2.2.8 左聚糖蔗糖酶聚合活力的测定 | 第53页 |
| 2.2.2.9 左聚糖蔗糖酶聚合活力性质测定 | 第53-54页 |
| 2.2.2.10 左聚糖蔗糖酶生成左聚糖的产物组成分析 | 第54-55页 |
| 2.2.3 左聚糖蔗糖酶高通量筛选体系的建立 | 第55-56页 |
| 2.2.3.1 左聚糖蔗糖酶产生菌野生型突变体的筛选 | 第55页 |
| 2.2.3.2 左聚糖蔗糖酶突变体大肠杆菌重组子的筛选 | 第55-56页 |
| 2.2.4 左聚糖蔗糖酶基因定向进化 | 第56-57页 |
| 2.2.4.1 易错PCR引物 | 第56页 |
| 2.2.4.2 易错PCR方法 | 第56-57页 |
| 2.2.5 左聚糖蔗糖酶融合蛋白的设计与构建 | 第57-59页 |
| 2.2.5.1 左聚糖蔗糖酶融合基因的设计 | 第57-58页 |
| 2.2.5.2 融合蛋白PCR引物的设计 | 第58页 |
| 2.2.5.3 PCR扩增及载体构建 | 第58-59页 |
| 2.2.6 左聚糖蔗糖酶三维结构同源建模 | 第59-60页 |
| 2.2.6.1 构建三维结构同源模型 | 第59页 |
| 2.2.6.2 同源建模结果分析 | 第59-60页 |
| 第三章 结果与分析 | 第60-122页 |
| 3.1 产左聚糖蔗糖酶芽孢杆菌的筛选 | 第60-63页 |
| 3.1.1 产左聚糖蔗糖酶野生型突变株筛选体系的建立 | 第60-62页 |
| 3.1.2 嗜热菌Geobacillus sp. HB1的分离 | 第62页 |
| 3.1.3 菌株的鉴定及系统树建立 | 第62-63页 |
| 3.2 芽孢杆菌左聚糖蔗糖酶基因的克隆 | 第63-73页 |
| 3.2.1 枯草芽孢杆菌左聚糖蔗糖酶(levansucrase) SacB基因的克隆 | 第63-69页 |
| 3.2.1.1 表达载体pSE-SS54A和pSE-SS56A的构建 | 第65-67页 |
| 3.2.1.2 重组蛋白SS54A和SS56A在大肠杆菌中的诱导表达及纯化 | 第67-69页 |
| 3.2.2 从嗜热菌Geobacillus sp. HB1克隆SacB基因 | 第69-71页 |
| 3.2.2.1 基因HBR1的PCR扩增 | 第69页 |
| 3.2.2.2 表达载体pET-HBR1的构建 | 第69-70页 |
| 3.2.2.3 重组蛋白HBR1在大肠杆菌的诱导表达及纯化 | 第70-71页 |
| 3.2.3 从嗜热地芽孢杆菌克隆SacB基因 | 第71-73页 |
| 3.2.3.1 基因9823SB的PCR扩增 | 第71页 |
| 3.2.3.2 表达载体pET-9823SB的构建 | 第71-72页 |
| 3.2.3.3 重组蛋白9823SB在大肠杆菌的诱导表达及纯化 | 第72-73页 |
| 3.3 左聚糖蔗糖酶基因的分子改造 | 第73-79页 |
| 3.3.1 左聚糖蔗糖酶重组子高效筛选体系的建立 | 第73-75页 |
| 3.3.2 易错PCR突变体库建立 | 第75页 |
| 3.3.3 左聚糖蔗糖酶基因突变体的筛选 | 第75-78页 |
| 3.3.4 重组蛋白T305A在大肠杆菌的诱导表达及纯化 | 第78-79页 |
| 3.4 左聚糖蔗糖酶融合蛋白的设计和构建 | 第79-81页 |
| 3.4.1 融合蛋白所需基因片段的克隆 | 第79-80页 |
| 3.4.2 两步连接法构建融合蛋白表达载体pSE-STHB6 | 第80页 |
| 3.4.3 重组融合蛋白STHB6的诱导表达及纯化 | 第80-81页 |
| 3.5 重组左聚糖蔗糖酶的序列比对分析 | 第81-90页 |
| 3.5.1 重组左聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列比对分析 | 第81页 |
| 3.5.2 重组左聚糖蔗糖酶的氨基酸序列比对分析 | 第81-90页 |
| 3.6 重组左聚糖蔗糖酶的酶学性质研究 | 第90-116页 |
| 3.6.1 重组左聚糖蔗糖酶水解酶活性的研究 | 第90-103页 |
| 3.6.1.1 水解活力最适pH的研究 | 第90-92页 |
| 3.6.1.2 水解活力最适温度的研究 | 第92-95页 |
| 3.6.1.3 水解活力热稳定性的研究 | 第95-98页 |
| 3.6.1.4 水解活力的Km值和Vmax值测定 | 第98-100页 |
| 3.6.1.5 部分金属离子和去污剂对左聚糖蔗糖酶水解活力的影响 | 第100-103页 |
| 3.6.2 重组左聚糖蔗糖酶聚合酶活性的研究 | 第103-116页 |
| 3.6.2.1 pH对左聚糖蔗糖酶产生左聚糖的影响 | 第103-105页 |
| 3.6.2.2 温度对左聚糖蔗糖酶产左聚糖的影响 | 第105-108页 |
| 3.6.2.3 蔗糖底物浓度对左聚糖蔗糖酶产生左聚糖的影响 | 第108-110页 |
| 3.6.2.4 反应时间对左聚糖蔗糖酶产生左聚糖的影响 | 第110-112页 |
| 3.6.2.5 左聚糖蔗糖酶催化蔗糖生成产物的初步鉴定分析 | 第112-116页 |
| 3.7 重组左聚糖蔗糖酶三维结构的同源建模及分析 | 第116-122页 |
| 3.7.1 重组蛋白的同源建模方法 | 第116页 |
| 3.7.2 重组蛋白的三维结构比对分析 | 第116-122页 |
| 第四章 结论与展望 | 第122-127页 |
| 4.1 结论 | 第122-124页 |
| 4.1.1 建立了野生型产左聚糖蔗糖酶菌株的快速筛选方法 | 第122页 |
| 4.1.2 建立了一步法高效筛选左聚糖蔗糖酶重组子的平板选择方法 | 第122页 |
| 4.1.3 克隆了多个芽孢杆菌左聚糖蔗糖酶基因 | 第122页 |
| 4.1.4 表达和纯化了多个重组左聚糖蔗糖酶并研究了其酶学性质 | 第122-123页 |
| 4.1.5 分子改造获得了高底物浓度下高转化率的左聚糖蔗糖酶突变体 | 第123页 |
| 4.1.6 构建了可在高温高底物浓度下高效合成左聚糖的融合蛋白左聚糖蔗糖酶 | 第123-124页 |
| 4.1.7 通过同源建模比对分析氨基酸残基功能 | 第124页 |
| 4.2 讨论 | 第124-126页 |
| 4.3 展望 | 第126-127页 |
| 参考文献 | 第127-138页 |
| 附录 | 第138-144页 |
| 致谢 | 第144-145页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第145页 |
