| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 符号说明 | 第11-13页 |
| 第1章 绪论 | 第13-31页 |
| 1.1 心脑血管疾病现况 | 第13-14页 |
| 1.1.1 血栓性疾病概况 | 第13-14页 |
| 1.1.2 血栓性疾病治疗现状 | 第14页 |
| 1.2 水蛭素 | 第14-19页 |
| 1.2.1 水蛭素的结构功能 | 第15-16页 |
| 1.2.2 凝血酶结构与功能 | 第16-17页 |
| 1.2.3 水蛭素的优势与弊端 | 第17-18页 |
| 1.2.4 新蛭素 | 第18-19页 |
| 1.3 融合蛋白类药物 | 第19-26页 |
| 1.3.1 蛋白药物代谢 | 第19-20页 |
| 1.3.2 融合蛋白类型 | 第20页 |
| 1.3.3 PEG化修饰药物 | 第20-21页 |
| 1.3.4 Fc融合蛋白 | 第21-26页 |
| 1.3.4.1 Fc融合蛋白简介 | 第21-22页 |
| 1.3.4.2 FcRn介绍及其延长半衰期的原理 | 第22-24页 |
| 1.3.4.3 Fc的结合位点突变 | 第24-25页 |
| 1.3.4.4 Fc融合蛋白的目前进展 | 第25-26页 |
| 1.4 融合蛋白连接短肽 | 第26-27页 |
| 1.4.1 Linker的类型 | 第26-27页 |
| 1.4.2 Linker的设计 | 第27页 |
| 1.5 实验设计与技术路线 | 第27-29页 |
| 1.5.1 实验设计 | 第27-29页 |
| 1.5.2 技术路线 | 第29页 |
| 1.6 研究目的与意义 | 第29-31页 |
| 第2章 不同连接肽pET-24a-pelB-eh-L-Fc的构建及其在E.coli BL21中的表达 | 第31-51页 |
| 2.1 材料与仪器 | 第31-35页 |
| 2.1.1 主要材料 | 第31页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第31-32页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第32页 |
| 2.1.4 主要试剂配制 | 第32-34页 |
| 2.1.5 实验所用序列 | 第34-35页 |
| 2.2 实验方法 | 第35-42页 |
| 2.2.1 目的基因扩增 | 第35-38页 |
| 2.2.2 pET-24a-pelB-eh-L-Fc重组质粒的构建 | 第38-39页 |
| 2.2.2.1 双酶切 | 第38页 |
| 2.2.2.2 连接转化 | 第38-39页 |
| 2.2.3 重组表达载体pET-24a-pelB-eh-L-Fc的验证 | 第39-41页 |
| 2.2.3.1 菌液PCR鉴定阳性克隆 | 第39-40页 |
| 2.2.3.2 双酶切鉴定阳性克隆 | 第40页 |
| 2.2.3.3 送测序鉴定阳性克隆 | 第40-41页 |
| 2.2.4 重组pET-24a-pelB-eh-L-Fc质粒在E.coli BL21中诱导表达 | 第41-42页 |
| 2.2.4.1 重组pET-24a-pelB-eh-L-Fc载体摇瓶的表达条件优化 | 第41页 |
| 2.2.4.2 样品处理 | 第41页 |
| 2.2.4.3 目的蛋白的鉴定及表达方式的确定 | 第41-42页 |
| 2.3 实验结果 | 第42-49页 |
| 2.3.1 PCR扩增基因片段结果 | 第42页 |
| 2.3.2 SOE-PCR获得融合目的基因 | 第42-43页 |
| 2.3.3 pET-24a-pelB-eh-L-Fc质粒验证结果图 | 第43-44页 |
| 2.3.4 目的蛋白诱导表达及鉴定 | 第44-49页 |
| 2.3.4.1 IPTG对菌体生长的影响 | 第44-45页 |
| 2.3.4.2 融合蛋白表达检测 | 第45-49页 |
| 2.4 讨论 | 第49-50页 |
| 2.5 本章结论 | 第50-51页 |
| 第3章 pcDNA3.1-Eh-L-Fc在CHO细胞中的表达、纯化及活性分析 | 第51-76页 |
| 3.1 材料与仪器 | 第51-56页 |
| 3.1.1 主要材料 | 第51页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第51-52页 |
| 3.1.3 主要仪器 | 第52-53页 |
| 3.1.4 主要试剂配制 | 第53-55页 |
| 3.1.5 实验所用序列 | 第55-56页 |
| 3.2 实验方法 | 第56-66页 |
| 3.2.1 表达载体构建 | 第56-58页 |
| 3.2.2 CHO的培养、转染与筛选 | 第58-61页 |
| 3.2.2.1 DMEM-F12培养基的配置 | 第58页 |
| 3.2.2.2 CHO细胞复苏 | 第58页 |
| 3.2.2.3 细胞传代 | 第58-59页 |
| 3.2.2.4 细胞计数与铺孔板 | 第59页 |
| 3.2.2.5 瞬时转染CHO细胞 | 第59-60页 |
| 3.2.2.6 G418筛选浓度确定 | 第60页 |
| 3.2.2.7 稳定高表达细胞株的筛选 | 第60页 |
| 3.2.2.8 细胞冻存 | 第60-61页 |
| 3.2.3 蛋白表达检测 | 第61-63页 |
| 3.2.3.1 转录水平检测蛋白表达 | 第61-62页 |
| 3.2.3.2 Western Blot检测蛋白表达 | 第62-63页 |
| 3.2.4 融合蛋白的表达纯化 | 第63-64页 |
| 3.2.5 纯化蛋白浓度与纯度检测 | 第64-65页 |
| 3.2.5.1 纯化蛋白浓度测定 | 第64页 |
| 3.2.5.2 纯化蛋白纯度测定 | 第64-65页 |
| 3.2.6 融合蛋白分子量测定 | 第65页 |
| 3.2.7 体外活性检测 | 第65-66页 |
| 3.2.7.1 溶液的配制 | 第65页 |
| 3.2.7.2 融合蛋白活性测定 | 第65页 |
| 3.2.7.3 活性单位的定议和计算 | 第65-66页 |
| 3.3 实验结果 | 第66-74页 |
| 3.3.1 目的基因的PCR扩增 | 第66-67页 |
| 3.3.2 重组表达载体的构建及验证 | 第67-69页 |
| 3.3.3 转录水平(RT-PCR)检测融合蛋白表达 | 第69-70页 |
| 3.3.4 翻译水平检测融合蛋白的表达 | 第70-71页 |
| 3.3.5 稳定性检测 | 第71页 |
| 3.3.6 EH-L-Fc蛋白的纯化及检测 | 第71-73页 |
| 3.3.7 融合蛋白表达量比较 | 第73页 |
| 3.3.8 生物活性检测 | 第73-74页 |
| 3.4 讨论 | 第74-75页 |
| 3.5 本章结论 | 第75-76页 |
| 第4章 结论 | 第76-77页 |
| 参考文献 | 第77-82页 |
| 致谢 | 第82-83页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第83-84页 |
