| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 第一章 绪论 | 第12-17页 |
| 1.1 胰蛋白酶原和胰蛋白酶 | 第12-14页 |
| 1.1.1 胰蛋白酶原和胰蛋白酶简介 | 第12页 |
| 1.1.2 胰蛋白酶的激活和作用机制 | 第12页 |
| 1.1.3 胰蛋白酶的获取途径和研究进展 | 第12-14页 |
| 1.2 胰蛋白酶的应用 | 第14页 |
| 1.3 P. pastoris表达系统 | 第14-16页 |
| 1.4 本公司针对胰蛋白酶的研究和应用 | 第16-17页 |
| 第二章 重组胰蛋白酶原P. pastoris菌株的构建和摇瓶培养工艺研究 | 第17-34页 |
| 2.1 引言 | 第17页 |
| 2.2 实验材料 | 第17-19页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第17-18页 |
| 2.2.2 仪器设备 | 第18页 |
| 2.2.3 主要试剂 | 第18-19页 |
| 2.3 实验方法 | 第19-24页 |
| 2.3.1 重组工程菌的构建 | 第19-21页 |
| 2.3.1.1 构建流程介绍 | 第19页 |
| 2.3.1.2 重组表达质粒的获得 | 第19-21页 |
| 2.3.1.3 高表达菌株的筛选与验证 | 第21页 |
| 2.3.2 细胞库的建立 | 第21-23页 |
| 2.3.2.1 细胞库概述 | 第21页 |
| 2.3.2.2 主细胞库的制备及检定 | 第21-23页 |
| 2.3.2.3 工作细胞的制备及检定 | 第23页 |
| 2.3.3 细胞库稳定性研究 | 第23-24页 |
| 2.3.3.1 传代稳定性 | 第23-24页 |
| 2.3.3.2 主细胞库保藏稳定性 | 第24页 |
| 2.3.3.3 工作细胞库保藏稳定性 | 第24页 |
| 2.3.4 培养工艺研究 | 第24页 |
| 2.3.4.1 生长曲线 | 第24页 |
| 2.3.4.2 摇瓶培养工艺 | 第24页 |
| 2.4 结果与分析 | 第24-33页 |
| 2.4.1 重组质粒pPIC9k-Trypsin双酶切鉴定 | 第24-25页 |
| 2.4.2 重组工程菌的构建结果 | 第25-26页 |
| 2.4.2.1 高表达菌株的筛选与验证结果 | 第25-26页 |
| 2.4.3 细胞库的建立结果 | 第26-30页 |
| 2.4.3.1 细胞库检测结果 | 第26-27页 |
| 2.4.3.2 主细胞库的制备及检定结果 | 第27-30页 |
| 2.4.4 细胞库稳定性研究结果 | 第30-31页 |
| 2.4.4.1 传代稳定性结果 | 第30-31页 |
| 2.4.4.2 工作细胞库保藏稳定性结果 | 第31页 |
| 2.4.5 培养工艺研究结果 | 第31-33页 |
| 2.4.5.1 生长曲线结果 | 第31-32页 |
| 2.4.5.2 摇瓶培养工艺结果 | 第32-33页 |
| 2.5 本章小结 | 第33-34页 |
| 第三章 P. pastoris表达重组胰蛋白酶原的发酵条件优化 | 第34-47页 |
| 3.1 引言 | 第34页 |
| 3.2 实验材料 | 第34-35页 |
| 3.2.1 实验仪器 | 第34-35页 |
| 3.3 实验方法 | 第35-38页 |
| 3.3.1 初始发酵培养基 | 第35页 |
| 3.3.2 初始发酵工艺 | 第35-36页 |
| 3.3.3 菌体浓度测定 | 第36页 |
| 3.3.4 重组胰蛋白酶原含量的测定 | 第36-38页 |
| 3.4 结果与分析 | 第38-46页 |
| 3.4.1 最佳接种时间的确定 | 第38-39页 |
| 3.4.2 最佳接种量的确定 | 第39-40页 |
| 3.4.3 最佳培养基的确定 | 第40-42页 |
| 3.4.4 最佳诱导菌体浓度的确定 | 第42页 |
| 3.4.5 最佳诱导pH的确定 | 第42-43页 |
| 3.4.6 最佳培养温度的确定 | 第43页 |
| 3.4.7 最佳甲醇补加速率的确定 | 第43-44页 |
| 3.4.8 有机氮源的补加 | 第44页 |
| 3.4.9 甲醇中补加尿素 | 第44-45页 |
| 3.4.10 发酵周期的确定 | 第45-46页 |
| 3.5 本章小结 | 第46-47页 |
| 第四章 P. pastoris表达重组胰蛋白酶原的发酵放大 | 第47-51页 |
| 4.1 实验材料 | 第47页 |
| 4.1.1 实验仪器 | 第47页 |
| 4.2 实验方法 | 第47-48页 |
| 4.2.1 培养基 | 第47页 |
| 4.2.2 补料分批发酵 | 第47-48页 |
| 4.2.3 菌体浓度测定 | 第48页 |
| 4.2.4 重组胰蛋白酶原含量的测定 | 第48页 |
| 4.3 结果与分析 | 第48-50页 |
| 4.3.1 种子罐的摇瓶接种量 | 第48-49页 |
| 4.3.2 发酵培养 | 第49-50页 |
| 4.4 本章小结 | 第50-51页 |
| 第五章 总结与展望 | 第51-53页 |
| 5.1 总结 | 第51-52页 |
| 5.2 展望 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-57页 |
| 附录 | 第57-59页 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 | 第59-60页 |
| 致谢 | 第60-61页 |
| 附件 | 第61页 |
