| 致谢 | 第4-8页 |
| 摘要 | 第8-10页 |
| 1 文献综述 | 第10-29页 |
| 1.1 漆酶研究状况 | 第10-15页 |
| 1.1.1 漆酶的结构特征 | 第10-13页 |
| 1.1.2 漆酶的理化性质 | 第13-14页 |
| 1.1.3 漆酶的应用 | 第14-15页 |
| 1.2 常见基因克隆策略 | 第15-21页 |
| 1.2.1 cDNA文库 | 第15-17页 |
| 1.2.2 RACE | 第17-21页 |
| 1.3 常用的外源基因表达系统 | 第21-26页 |
| 1.3.1 大肠杆菌pET表达系统 | 第21-22页 |
| 1.3.2 巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第22-26页 |
| 1.4 漆酶基因的克隆及表达 | 第26-29页 |
| 2 引言 | 第29-30页 |
| 3 材料与方法 | 第30-43页 |
| 3.1 材料 | 第30-31页 |
| 3.1.1 菌株和载体 | 第30页 |
| 3.1.2 试剂与药品 | 第30页 |
| 3.1.3 培养基 | 第30-31页 |
| 3.1.4 仪器设备 | 第31页 |
| 3.2 流程 | 第31-34页 |
| 3.2.1 漆酶基因的克隆 | 第31页 |
| 3.2.2 漆酶基因在大肠杆菌中的表达 | 第31-33页 |
| 3.2.3 漆酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第33-34页 |
| 3.3 方法 | 第34-43页 |
| 3.3.1 漆酶酶活力测定 | 第34页 |
| 3.3.2 漆酶总DNA的提取 | 第34-35页 |
| 3.3.3 漆酶总RNA的提取 | 第35页 |
| 3.3.4 杏鲍菇漆酶gDNA的克隆 | 第35-36页 |
| 3.3.5 杏鲍菇漆酶cDNA的克隆 | 第36-37页 |
| 3.3.6 核酸片断的纯化 | 第37页 |
| 3.3.7 质粒的提取 | 第37页 |
| 3.3.8 酶切体系 | 第37-38页 |
| 3.3.9 重组载体的构建 | 第38-39页 |
| 3.3.10 感受态细胞的制备 | 第39-40页 |
| 3.3.11 转化 | 第40页 |
| 3.3.12 阳性转化子的筛选 | 第40页 |
| 3.3.13 漆酶的异源诱导表达 | 第40-41页 |
| 3.3.14 漆酶基因在大肠杆菌BL21中表达的SDS—PAGE检测 | 第41页 |
| 3.3.15 杏鲍菇漆酶信号肽的分析 | 第41页 |
| 3.3.16 漆酶的高级结构预测 | 第41页 |
| 3.3.17 漆酶酶学性质分析 | 第41-43页 |
| 4 结果与分析 | 第43-61页 |
| 4.1 引物序列 | 第43页 |
| 4.2 漆酶基因的克隆 | 第43-48页 |
| 4.2.1 漆酶总RNA的提取 | 第43-44页 |
| 4.2.2 RT—PCR扩增漆酶基因 | 第44页 |
| 4.2.3 杏鲍菇总DNA的提取 | 第44页 |
| 4.2.4 gDNA的PCR扩增 | 第44-45页 |
| 4.2.5 漆酶基因的TA克隆及测序结果 | 第45-48页 |
| 4.3 杏鲍菇漆酶信号肽的预测 | 第48-49页 |
| 4.4 漆酶高级结构预测 | 第49-52页 |
| 4.4.1 杏鲍菇漆酶二级结构预测 | 第49-51页 |
| 4.4.2 杏鲍菇漆酶三级结构的预测 | 第51-52页 |
| 4.5 漆酶基因的原核表达 | 第52-54页 |
| 4.5.1 pET21b—cDNA的构建 | 第52-53页 |
| 4.5.2 pET21b—cDNA表达产物的检测结果 | 第53-54页 |
| 4.6 漆酶基因的真核表达 | 第54-57页 |
| 4.6.1 pPIC9K-cDNA重组载体的构建 | 第54-55页 |
| 4.6.2 pPIC9K-lac线性化后转化毕赤酵母GS115 | 第55-56页 |
| 4.6.3 诱导表达 | 第56-57页 |
| 4.7 Cu离子浓度对重组漆酶酶活的影响 | 第57-58页 |
| 4.8 培养温度对重组漆酶酶活的影 | 第58页 |
| 4.9 漆酶的酶学性质分析 | 第58-61页 |
| 4.9.1 最适反应温度 | 第58-59页 |
| 4.9.2 温度稳定性 | 第59页 |
| 4.9.3 最适pH | 第59-60页 |
| 4.9.4 pH稳定性 | 第60-61页 |
| 5 结论与讨论 | 第61-63页 |
| 5.1 结论 | 第61页 |
| 5.2 讨论 | 第61-62页 |
| 5.3 展望 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-68页 |
| ABSTRACT | 第68-69页 |
