| 摘要 | 第9-11页 |
| ABSTRACT | 第11-13页 |
| 符号与缩略语说明 | 第14-15页 |
| 前言 | 第15-16页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-70页 |
| 1 芽孢杆菌发展简史 | 第16-17页 |
| 2 芽孢杆菌表达系统概述 | 第17-52页 |
| 2.1 芽孢杆菌表达系统的特点 | 第17-18页 |
| 2.2 宿主系统 | 第18-23页 |
| 2.3 载体系统 | 第23-31页 |
| 2.4 转化系统 | 第31-38页 |
| 2.5 表达系统 | 第38-52页 |
| 3 芽孢杆菌表达系统存在问题及今后发展方向 | 第52-55页 |
| 3.1 关于表达真核基因方面 | 第52-53页 |
| 3.2 关于表达酶的方面 | 第53-54页 |
| 3.3 关于表达杀虫晶体蛋白(ICP)方面 | 第54页 |
| 3.4 关于致病菌炭疽芽孢杆菌方面 | 第54页 |
| 3.5 利用芽孢杆菌基因工程技术扩大和加强芽孢杆菌在各方面的应用 | 第54-55页 |
| 4 芽孢杆菌孢子表面展示 | 第55-57页 |
| 4.1 枯草芽孢杆菌芽孢结构 | 第55-56页 |
| 4.2 枯草芽孢杆菌芽孢生理及理化特性 | 第56页 |
| 4.3 芽孢表面展示的应用 | 第56-57页 |
| 5 Cre/loxP定点重组系统 | 第57-59页 |
| 参考文献 | 第59-70页 |
| 第二章 基于Cre/loxP和PCR的枯草杆菌基因组操作方法的建立及其应用 | 第70-98页 |
| 第一节 基于Cre/loxP定点重组系统和PCR的一步法基因敲除 | 第72-86页 |
| 1 材料与方法 | 第72-78页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第72页 |
| 1.2 培养条件和营养缺陷型的鉴定 | 第72页 |
| 1.3 淀粉酶活性的检测 | 第72页 |
| 1.4 甲基对硫磷水解酶活性的检测 | 第72页 |
| 1.5 转化方法 | 第72-75页 |
| 1.6 引物、测序和工具酶 | 第75页 |
| 1.7 质粒和总DNA的提取 | 第75页 |
| 1.8 载体的构建 | 第75-76页 |
| 1.9 PCR融合步骤 | 第76-77页 |
| 1.10 核酸序列的GenBank登录号 | 第77-78页 |
| 2 结果与分析 | 第78-85页 |
| 2.1 基于Cre/loxP定点重组系统和PCR的枯草杆菌基因敲除系统的原理 | 第78页 |
| 2.2 敲除淀粉酶基因(amyE)和删除原噬菌体3(prophage 3)区域 | 第78-80页 |
| 2.3 组氨酸操纵子中hisZ基因的框内删除(in-frame deletion) | 第80-81页 |
| 2.4 缩短删除区域上下同源臂的长度 | 第81-82页 |
| 2.5 比较不同lox位点间Cre重组酶介导的体内(in vivo)重组效率 | 第82-83页 |
| 2.6 突变过程的进一步简化(将cre基因IPTG诱导表达盒插入染色体中) | 第83-85页 |
| 3 讨论 | 第85-86页 |
| 第二节 WB800菌株中抗性基因的删除以及基因工程菌的构建 | 第86-92页 |
| 1 材料与方法 | 第86-89页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第86-87页 |
| 1.2 培养条件 | 第87页 |
| 1.3 淀粉酶活性的检测 | 第87页 |
| 1.4 甲基对硫磷水解酶活性的检测 | 第87-88页 |
| 1.5 转化方法 | 第88页 |
| 1.6 引物、测序和工具酶 | 第88-89页 |
| 1.7 质粒和总DNA的提取 | 第89页 |
| 1.8 PCR条件 | 第89页 |
| 2 结果与分析 | 第89-91页 |
| 2.1 WB800菌株中抗性基因的删除 | 第89页 |
| 2.2 基因工程菌BSM1的构建 | 第89-91页 |
| 3 讨论 | 第91-92页 |
| 第三节 枯草杆菌原噬菌体3(prophage 3)区域的删除对质粒转化效率的影响 | 第92-95页 |
| 1 材料与方法 | 第92-93页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第92页 |
| 1.2 培养条件 | 第92页 |
| 1.3 甲基对硫磷水解酶活性的检测 | 第92页 |
| 1.4 转化方法 | 第92-93页 |
| 1.5 工具酶 | 第93页 |
| 2 结果与分析 | 第93-94页 |
| 2.1 质粒的选择 | 第93页 |
| 2.2 质粒的修饰 | 第93-94页 |
| 2.3 转化效率 | 第94页 |
| 3 讨论 | 第94-95页 |
| 本章小结 | 第95页 |
| 参考文献 | 第95-98页 |
| 第三章 毕赤酵母(Pichia pastoris)基因的一步法敲除 | 第98-108页 |
| 1 材料与方法 | 第99-102页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第99页 |
| 1.2 培养条件 | 第99页 |
| 1.3 转化方法 | 第99-100页 |
| 1.4 引物、测序和工具酶 | 第100页 |
| 1.5 质粒和基因组DNA的提取 | 第100页 |
| 1.6 基因敲除盒的构建 | 第100-101页 |
| 1.7 PCR融合步骤 | 第101-102页 |
| 2 结果与分析 | 第102-105页 |
| 2.1 基于Cre/loxP定点重组系统和PCR的P.pastoris基因敲除系统的原理 | 第102-103页 |
| 2.2 his4基因的敲除 | 第103-104页 |
| 2.3 pep4基因的敲除 | 第104-105页 |
| 3 讨论 | 第105页 |
| 4 本章小结 | 第105页 |
| 参考文献 | 第105-108页 |
| 第四章 用枯草芽孢杆菌孢子表面展示有机磷水解酶 | 第108-116页 |
| 1 材料与方法 | 第109-112页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第109页 |
| 1.2 培养条件 | 第109页 |
| 1.3 淀粉酶活性的检测 | 第109页 |
| 1.4 甲基对硫磷水解酶酶活力的测定 | 第109-110页 |
| 1.5 转化方法 | 第110页 |
| 1.6 引物、测序和工具酶 | 第110页 |
| 1.7 蛋白酶K敏感性分析 | 第110-111页 |
| 1.8 载体的构建 | 第111-112页 |
| 1.9 重组菌株的构建 | 第112页 |
| 2 结果与分析 | 第112-113页 |
| 2.1 将mpd基因和cotG基因融合 | 第112-113页 |
| 2.2 孢子表面展示MPH | 第113页 |
| 2.3 重组孢子的存储 | 第113页 |
| 3 讨论 | 第113-114页 |
| 4 本章小结 | 第114页 |
| 参考文献 | 第114-116页 |
| 第五章 野生芽孢杆菌转化的研究和应用 | 第116-126页 |
| 第一节 野生芽孢杆菌转化机理的研究 | 第116-122页 |
| 1 材料与方法 | 第116-119页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第116-117页 |
| 1.2 培养条件 | 第117页 |
| 1.3 甲基对硫磷水解酶活性的检测 | 第117页 |
| 1.4 转化方法 | 第117-118页 |
| 1.5 工具酶 | 第118页 |
| 1.6 质粒和总DNA的提取 | 第118页 |
| 1.7 质粒的滤膜转移方法 | 第118页 |
| 1.8 质粒的液体转移方法 | 第118页 |
| 1.9 DNase Ⅰ对质粒转移影响试验 | 第118-119页 |
| 2 结果与分析 | 第119-121页 |
| 2.1 液体转移方法 | 第119页 |
| 2.2 质粒是通过感受态转移的 | 第119页 |
| 2.3 质粒的来源对转化的影响 | 第119-120页 |
| 2.4 质粒的形式对转化的影响 | 第120-121页 |
| 3 讨论 | 第121-122页 |
| 第二节 有机磷水解酶(MPH)在野生芽孢杆菌中表达的初步研究 | 第122-125页 |
| 1 材料与方法 | 第122-123页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第122页 |
| 1.2 培养条件 | 第122页 |
| 1.3 甲基对硫磷水解酶活性的检测和活力的测定 | 第122页 |
| 1.4 转化方法 | 第122-123页 |
| 1.5 质粒的提取 | 第123页 |
| 2 结果与分析 | 第123-124页 |
| 2.1 质粒pP15NMK | 第123页 |
| 2.2 (MPH)在野生芽孢杆菌中表达 | 第123-124页 |
| 3 讨论 | 第124-125页 |
| 4 本章小结 | 第125页 |
| 参考文献 | 第125-126页 |
| 第六章 全文总结 | 第126-130页 |
| 1 全文研究内容总结、讨论与展望 | 第126-127页 |
| 2 本论文研究的主要创新点 | 第127-130页 |
| 附录 | 第130-150页 |
| 附录1 枯草杆菌普通化学感受态细胞制备用试剂 | 第130-131页 |
| 附录2 甲基对硫磷酶活测定所用仪器及试剂 | 第131-132页 |
| 附录3 载体序列 | 第132-150页 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 | 第150-152页 |
| 致谢 | 第152页 |
