| 中文摘要 | 第10-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-47页 |
| 1．1 抗虫植物基因工程研究进展 | 第14-30页 |
| 1．1．1 第一代抗虫基因 | 第16-24页 |
| 1．1．1．1 Bt杀虫晶体蛋白基因 | 第16-20页 |
| 1．1．1．1．1 Bt杀虫晶体蛋白的结构及功能 | 第16-18页 |
| 1．1．1．1．2 Bt杀虫晶体蛋白的杀虫机理 | 第18-19页 |
| 1．1．1．1．3 Bt杀虫晶体蛋白基因及转基因作物 | 第19-20页 |
| 1．1．1．2 其它杀虫蛋白基因 | 第20-24页 |
| 1．1．1．2．1 动物来源的毒素基因 | 第20-21页 |
| 1．1．1．2．2 蛋白酶抑制剂基因 | 第21-22页 |
| 1．1．1．2．3 凝集素基因 | 第22-24页 |
| 1．1．2 第二代抗虫基因 | 第24-30页 |
| 1．1．2．1 毒素复合体 | 第24-25页 |
| 1．1．2．2 营养杀虫蛋白基因 | 第25-26页 |
| 1．1．2．3 双价/多价抗虫基因 | 第26-28页 |
| 1．1．2．3．1 双价/多价杀虫蛋白可以延缓昆虫对抗虫植物产生抗性的进程并拓宽转基因植物的杀虫谱 | 第27页 |
| 1．1．2．3．2 双价杀虫蛋白在杀虫作用上具有协同增效性 | 第27-28页 |
| 1．1．2．4 融合抗虫基因 | 第28-30页 |
| 1．2 胆固醇氧化酶及其基因工程研究进展 | 第30-42页 |
| 1．2．1 胆固醇氧化酶 | 第31-35页 |
| 1．2．1．1 胆固醇氧化酶的基本特性 | 第31-32页 |
| 1．2．1．2 胆固醇氧化酶的主要用途 | 第32页 |
| 1．2．1．3 胆固醇氧化酶的催化效率 | 第32-33页 |
| 1．2．1．4 胆固醇氧化酶的作用机理 | 第33-35页 |
| 1．2．2 胆固醇氧化酶基因 | 第35-42页 |
| 1．2．2．1 已分离的胆固醇氧化酶基因 | 第35-38页 |
| 1．2．2．1．1 链霉菌streptomyces sp．的胆固醇氧化酶基因choA | 第35-37页 |
| 1．2．2．1．2 甾短杆菌Brevibacterium sterolicum的胆固醇氧化酶基因choB | 第37-38页 |
| 1．2．2．1．3 choA与choB的比较 | 第38页 |
| 1．2．2．2 胆固醇氧化酶基因与基因工程 | 第38-42页 |
| 1．2．2．2．1 胆固醇氧化酶基因微生物基因工程 | 第38-39页 |
| 1．2．2．2．2 胆固醇氧化酶基因与抗虫植物基因工程 | 第39-42页 |
| 1．2．2．2．2．1 胆固醇氧化酶抗虫活性的发现 | 第39页 |
| 1．2．2．2．2．2 胆固醇氧化酶的杀虫效率 | 第39-40页 |
| 1．2．2．2．2．3 胆固醇氧化酶的杀虫谱 | 第40页 |
| 1．2．2．2．2．4 胆固醇氧化酶的杀虫机理 | 第40-41页 |
| 1．2．2．2．2．5 胆固醇氧化酶基因在抗虫植物基因工程中的应用 | 第41-42页 |
| 1．3 问题与展望 | 第42-45页 |
| 1．3．1 昆虫对杀虫蛋白抗性的产生及其解决措施 | 第43-44页 |
| 1．3．2 抗虫基因在植物体内的“沉默”现象 | 第44-45页 |
| 1．3．3 转抗虫基因植物潜在的生态风险性 | 第45页 |
| 1．4 本研究的目的意义 | 第45-47页 |
| 第二章 高产胆固醇氧化酶菌株的筛选及胆固醇氧化酶基因的克隆 | 第47-68页 |
| 2．1 材料与方法 | 第48-55页 |
| 2．1．1 材料 | 第48-49页 |
| 2．1．1．1 菌株 | 第48页 |
| 2．1．1．2 基础质粒 | 第48页 |
| 2．1．1．3 PCR扩增引物 | 第48页 |
| 2．1．1．4 试剂 | 第48-49页 |
| 2．1．2 方法 | 第49-55页 |
| 2．1．2．1 培养基 | 第49页 |
| 2．1．2．1．1 胆固醇唯一碳源限制培养基 | 第49页 |
| 2．1．2．1．2 LB培养基 | 第49页 |
| 2．1．2．2 胆固醇氧化酶活性检测 | 第49-50页 |
| 2．1．2．3 菌株杀虫实验 | 第50页 |
| 2．1．2．4 细菌基因组DNA提取 | 第50-51页 |
| 2．1．2．5 PCR扩增细菌胆固醇氧化酶 | 第51-52页 |
| 2．1．2．6 PCR片段的克隆及亚克隆的构建与鉴定 | 第52-55页 |
| 2．1．2．6．1 质粒DNA的小量提取 | 第52-53页 |
| 2．1．2．6．2 DNA的限制性酶切反应 | 第53页 |
| 2．1．2．6．3 目的DNA片段的电泳回收 | 第53-54页 |
| 2．1．2．6．4 外源片段与质粒DNA的连接反应 | 第54页 |
| 2．1．2．6．5 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第54-55页 |
| 2．1．2．6．6 质粒DNA转化大肠杆菌 | 第55页 |
| 2．1．2．6．7 转化子的快速筛选（Cracking Screen） | 第55页 |
| 2．2 结果与分析 | 第55-66页 |
| 2．2．1 高产胆固醇氧化酶菌株的筛选 | 第55-66页 |
| 2．2．1．1 菌株在以胆固醇为唯一碳源的限制性培养基中的生长状况 | 第55-57页 |
| 2．2．1．2 菌株产胆固醇氧化酶的情况 | 第57-59页 |
| 2．2．1．3 菌株杀虫实验结果 | 第59-62页 |
| 2．2．1．4 胆固醇氧化酶基因的克隆 | 第62-66页 |
| 2．2．1．5 PCR扩增片段与已知链霉菌胆固醇氧化酶基因编码序列的比较 | 第66页 |
| 2．3 小结 | 第66-68页 |
| 第三章 胆固醇氧化酶基因细菌表达载体的构建及其表达研究 | 第68-93页 |
| 3．1 材料与方法 | 第68-76页 |
| 3．1．1 材料 | 第68-69页 |
| 3．1．1．1 菌株 | 第68页 |
| 3．1．1．2 基础质粒 | 第68页 |
| 3．1．1．3 人工合成的寡核苷酸片段 | 第68-69页 |
| 3．1．2 方法（前文述及者略） | 第69-76页 |
| 3．1．2．1 高效细菌表达载体构建 | 第69-70页 |
| 3．1．2．2 电击法转化大肠杆菌BL21 | 第70-72页 |
| 3．1．2．3 细菌表达载体在大肠杆菌BL21中的诱导表达 | 第72页 |
| 3．1．2．4 蛋白质表达情况的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第72-74页 |
| 3．1．2．5 包涵体的初步纯化及溶解 | 第74-76页 |
| 3．2 结果与分析 | 第76-92页 |
| 3．2．1 胆固醇氧化酶基因高效细菌表达载体的构建 | 第76-83页 |
| 3．2．1．1 全酶基因细菌表达载体的构建 | 第76-77页 |
| 3．2．1．2 成熟酶基因细菌表达载体的构建 | 第77-80页 |
| 3．2．1．2 重新添加信号肽编码序列的成熟酶基因细菌表达载体的构建 | 第80-82页 |
| 3．2．1．3 pBV221choa-14a和pBV221choa-14b的构建 | 第82-83页 |
| 3．2．2 胆固醇氧化酶基因在大肠杆菌BL21中的表达 | 第83-85页 |
| 3．2．2．1 有无前导肽编码序列的胆固醇氧化酶基因在大肠杆菌中的表达 | 第83-84页 |
| 3．2．2．2 回复前导肽编码序列后的基因表达 | 第84-85页 |
| 3．2．3 回文结构对胆固醇氧化酶基因在大肠杆菌BL21中表达的影响 | 第85-88页 |
| 3．2．4 在大肠杆菌BL21中胆固醇氧化酶基因以包涵体的形式表达 | 第88-90页 |
| 3．2．5 胆固醇氧化酶基因在大肠杆菌中表达量的测定 | 第90-92页 |
| 3．3 小结 | 第92-93页 |
| 第四章 胆固醇氧化酶基因高效植物表达载体的构建及其植物转化 | 第93-137页 |
| 4．1 材料与方法 | 第94-111页 |
| 4．1．1 材料 | 第94-96页 |
| 4．1．1．1 菌株 | 第94页 |
| 4．1．1．2 植物 | 第94页 |
| 4．1．1．3 基础质粒 | 第94-96页 |
| 4．1．1．4 人工合成的寡核苷酸片段 | 第96页 |
| 4．1．1．5 试剂 | 第96页 |
| 4．1．2 方法（前文述及者略） | 第96-111页 |
| 4．1．2．1 细菌培养用YEB培养基 | 第96-97页 |
| 4．1．2．2 相关植物表达载体的构建 | 第97-101页 |
| 4．1．2．2．1 胆固醇氧化酶全酶基因及成熟酶基因高效植物表达载体构建 | 第97-98页 |
| 4．1．2．2．1．1 胆固醇氧化酶全酶基因高效细菌表达载体构建 | 第97-98页 |
| 4．1．2．2．1．2 胆固醇氧化酶成熟酶基因高效细菌表达载体构建 | 第98页 |
| 4．1．2．2．2 双价基因及高效植物表达载体构建 | 第98-100页 |
| 4．1．2．2．2．1 胆固醇氧化酶全酶基因与Bt GFM cryIA（c）构建双价植物表达载体 | 第98-99页 |
| 4．1．2．2．2．2 胆固醇氧化酶成熟酶基因与Bt GFM cryIA（c）构建双价植物表达载体 | 第99-100页 |
| 4．1．2．2．3 融合基因及高效植物表达载体构建 | 第100-101页 |
| 4．1．2．3 质粒DNA的大量提取及纯化 | 第101-102页 |
| 4．1．2．4 农杆菌感受态细胞的制备 | 第102页 |
| 4．1．2．5 重组质粒转入农杆菌菌株LBA4404细胞 | 第102-103页 |
| 4．1．2．6 烟草组织培养用相关培养基 | 第103-104页 |
| 4．1．2．6．1 基本培养基MS_0 | 第103-104页 |
| 4．1．2．6．2 共培养培养基 | 第104页 |
| 4．1．2．6．3 选择培养基 | 第104页 |
| 4．1．2．6．4 生根培养基 | 第104页 |
| 4．1．2．7 叶盘法转化烟草外植体 | 第104-105页 |
| 4．1．2．7．1 烟草无菌苗的准备 | 第104页 |
| 4．1．2．7．2 农杆菌的准备 | 第104页 |
| 4．1．2．7．3 烟草外植体叶盘法转化、培养及转基因植株再生 | 第104-105页 |
| 4．1．2．8 利用花粉管通道法转化棉花 | 第105页 |
| 4．1．2．9 转基因植物的生物测试 | 第105-106页 |
| 4．1．2．9．1 转基因烟草的生物测试（王志斌，1999） | 第105-106页 |
| 4．1．2．9．2 转基因棉花的生物测试 | 第106页 |
| 4．1．2．10 植物基因组DNA提取 | 第106-108页 |
| 4．1．2．10．1 烟草基因组DNA提取 | 第106-107页 |
| 4．1．2．10．2 棉花基因组DNA提取方法 | 第107-108页 |
| 4．1．2．11 转基因植株的PCR鉴定 | 第108-109页 |
| 4．1．2．12 转基因植物的斑点杂交检测及Southern杂交分析 | 第109-111页 |
| 4．1．2．12．1 转基因植物的斑点杂交检测 | 第109-110页 |
| 4．1．2．12．2 转基因植物的Southern杂交检测 | 第110-111页 |
| 4．2 结果与分析 | 第111-135页 |
| 4．2．1 相关植物表达载体的构建 | 第111-121页 |
| 4．2．1．1 胆固醇氧化酶全酶基因及成熟酶基因植物表达载体的构建 | 第111-114页 |
| 4．2．1．2 双价基因及高效植物表达载体构建 | 第114-117页 |
| 4．2．1．3 融合基因及高效植物表达载体构建 | 第117-121页 |
| 4．2．2 胆固醇氧化酶基因等在转基因烟草中的表达 | 第121-130页 |
| 4．2．2．1 植物表达载体向农杆菌中转化 | 第121-124页 |
| 4．2．2．2 转基因烟草的PCR检测 | 第124-122页 |
| 4．2．2．3 烟草的转化 | 第122-124页 |
| 4．2．2．4 转基因烟草的PCR检测 | 第124-125页 |
| 4．2．2．5 转基因烟草的斑点杂交检测 | 第125页 |
| 4．2．2．6 转基因烟草的Southern杂交检测 | 第125-129页 |
| 4．2．2．7 转基因烟草的胆固醇氧化酶活性检测 | 第129-130页 |
| 4．2．3 双价基因和融合基因在转基因棉花中的表达 | 第130-135页 |
| 4．2．3．1 花粉管通道法转化棉花植株 | 第130-131页 |
| 4．2．3．2 转基因棉花的PCR检测 | 第131页 |
| 4．2．3．3 转基因棉花的斑点杂交检测 | 第131-132页 |
| 4．2．3．4 转基因棉花的Southern杂交检测 | 第132-133页 |
| 4．2．3．5 转基因棉花的生物检测 | 第133-135页 |
| 4．3 小结 | 第135-137页 |
| 第五章 结论 | 第137-139页 |
| 参考文献 | 第139-147页 |
| 附录一 | 第147-150页 |
| 附录二 | 第150-151页 |
| 致谢 | 第151页 |
