| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 第一章 绪论 | 第13-29页 |
| 1.1 (R)-香茅醛简介 | 第13-15页 |
| 1.1.1 手性化合物 | 第13-14页 |
| 1.1.2 香茅醛的简介 | 第14-15页 |
| 1.2 柠檬醛 | 第15-19页 |
| 1.2.1 柠檬醛的简介 | 第15-16页 |
| 1.2.2 柠檬醛的立体选择性 | 第16-18页 |
| 1.2.2.1 柠檬醛的C=O加氢 | 第17-18页 |
| 1.2.2.2 柠檬醛α,β位C=C加氢 | 第18页 |
| 1.2.3 氨基酸催化的柠檬醛顺反异构化反应 | 第18-19页 |
| 1.3 (R)-香茅醛的合成 | 第19-22页 |
| 1.3.1 (R)-香茅醛的化学合成 | 第19-20页 |
| 1.3.2 (R)-香茅醛的生物合成 | 第20-22页 |
| 1.3.2.1 香茅醛的微生物合成 | 第20-21页 |
| 1.3.2.2 烯醇还原酶合成(R)-香茅醛 | 第21-22页 |
| 1.3.2.3 烯醇还原酶合成(S)-香茅醛 | 第22页 |
| 1.4 烯醇还原酶 | 第22-25页 |
| 1.4.1 烯醇还原酶的来源及功能 | 第22-23页 |
| 1.4.2 烯醇还原酶催化机理 | 第23-25页 |
| 1.5 烯醇还原酶的蛋白质工程改造 | 第25-27页 |
| 1.5.1 烯醇还原酶S. pastorianus OYE1的改造 | 第25-26页 |
| 1.5.2 烯醇还原酶B. subtilis YqjM的改造 | 第26-27页 |
| 1.6 本论文研究背景、内容及意义 | 第27-29页 |
| 第二章 S. cerevisiae OYE2不对称合成(R)-香茅醛 | 第29-45页 |
| 2.1 引言 | 第29-30页 |
| 2.2 实验材料 | 第30-32页 |
| 2.2.1 重组菌株 | 第30页 |
| 2.2.2 试剂 | 第30页 |
| 2.2.3 培养基 | 第30-31页 |
| 2.2.4 缓冲液 | 第31页 |
| 2.2.4.1 催化体系缓冲液的配制 | 第31页 |
| 2.2.4.2 Ni~(2+)柱蛋白纯化洗脱缓冲液的配制 | 第31页 |
| 2.2.5 主要仪器 | 第31-32页 |
| 2.3 实验方法 | 第32-34页 |
| 2.3.1 菌种培养 | 第32-33页 |
| 2.3.2 S. Cerevisiae OYE2和C. boidinii FDHCB表达和纯化 | 第33页 |
| 2.3.2.1 重组菌E. coli BL21/pEASY-E1-oye2诱导表达 | 第33页 |
| 2.3.2.2 老黄酶OYE2的分离纯化以及蛋白浓度的测定 | 第33页 |
| 2.3.3 (Z)-柠檬醛和(E)-柠檬醛的制备 | 第33-34页 |
| 2.4 异构化反应偶联不对称氢化反应的反应体系优化 | 第34页 |
| 2.5 色谱检测条件及各个物质标准曲线的准备 | 第34页 |
| 2.6 结果与讨论 | 第34-43页 |
| 2.6.0 烯醇还原酶OYE2和甲酸脱氢酶FDHCB表达和分离纯化 | 第34-35页 |
| 2.6.1 橙花醛和香叶醛的化学合成 | 第35-37页 |
| 2.6.2 各物质的气相色谱图及标准曲线绘制 | 第37-38页 |
| 2.6.3 氨基酸种类对(E/Z)-柠檬醛不对称氢化产物e.e.值的影响 | 第38-39页 |
| 2.6.4 甘氨酸浓度对(E/Z)-柠檬醛不对称氢化产物e.e.值的影响 | 第39页 |
| 2.6.5 反应pH值对(E/Z)-柠檬醛不对称氢化产物e.e.值的影响 | 第39-40页 |
| 2.6.6 不对称氢化反应偶联底物异构化反应的反应进程 | 第40-41页 |
| 2.6.7 底物与产物在OYE2催化过程中的对应关系 | 第41-43页 |
| 2.7 本章讨论与小结 | 第43-45页 |
| 第三章 S. cerevisiae OYE2的分子改造及其突变子的合成应用 | 第45-64页 |
| 3.1 引言 | 第45-46页 |
| 3.2 实验材料 | 第46-48页 |
| 3.2.1 菌种 | 第46页 |
| 3.2.2 试剂 | 第46页 |
| 3.2.3 培养基 | 第46页 |
| 3.2.4 缓冲液 | 第46-47页 |
| 3.2.5 主要仪器、设备及相关分析软件 | 第47-48页 |
| 3.3 实验方法 | 第48-53页 |
| 3.3.1 同源建模及分子对接 | 第48页 |
| 3.3.2 菌种培养 | 第48页 |
| 3.3.3 E. coli BL21/pEASY-E1-oye2重组质粒的提取 | 第48-49页 |
| 3.3.4 突变库的构建 | 第49-51页 |
| 3.3.5 大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)感受态的制备及转化 | 第51页 |
| 3.3.6 突变体阳性克隆子的初步鉴定及序列测序 | 第51-52页 |
| 3.3.7 OYE2突变子的分析 | 第52-53页 |
| 3.3.7.1 突变子诱导表达纯化 | 第52页 |
| 3.3.7.2 突变子催化柠檬醛不对称合成(R)-香茅醛的效果比对 | 第52-53页 |
| 3.4 结果与分析 | 第53-62页 |
| 3.4.1 同源建模及分子对接 | 第53-56页 |
| 3.4.1.1 S. cerevisiae OYE2同源建模 | 第53页 |
| 3.4.1.2 结合黄素FMN的S. cerevisiae OYE2三维结构模型 | 第53-54页 |
| 3.4.1.3 S. cerevisiae OYE2三维模型与底物柠檬醛的对接 | 第54-56页 |
| 3.4.2 菌种的培养及质粒的提取 | 第56页 |
| 3.4.3 突变子库的构建 | 第56-57页 |
| 3.4.4 突变子的诱导表达及纯化 | 第57-58页 |
| 3.4.5 OYE突变子不对称还原柠檬醛得率及立体选择性的对比 | 第58-59页 |
| 3.4.6 底物与产物在P75M催化过程中的对应关系 | 第59-60页 |
| 3.4.7 P75M与OYE2催化柠檬醛的效果比较 | 第60-62页 |
| 3.4.8 P75M 和 OYE2 分别与(Z)-柠檬醛分子对接的效果比较 | 第62页 |
| 3.5 本章讨论与小结 | 第62-64页 |
| 第四章 突变文库筛选方法的探索 | 第64-72页 |
| 4.1 引言 | 第64页 |
| 4.2 实验材料 | 第64-66页 |
| 4.2.1 菌种 | 第64-65页 |
| 4.2.2 试剂 | 第65页 |
| 4.2.3 培养基 | 第65-66页 |
| 4.2.4 主要仪器、设备及相关分析软件 | 第66页 |
| 4.3 实验方法 | 第66-68页 |
| 4.3.1 菌种培养 | 第66-67页 |
| 4.3.2 重组蛋白诱导表达纯化 | 第67页 |
| 4.3.3 柠檬醛荧光反应及标准曲线的绘制 | 第67页 |
| 4.3.4 荧光鉴定法用于突变文库的筛选效果 | 第67-68页 |
| 4.4 结果与分析 | 第68-70页 |
| 4.4.1 柠檬醛产生荧光情况 | 第68-69页 |
| 4.4.2 荧光鉴定法用于突变文库的筛选效果 | 第69-70页 |
| 4.5 本章讨论与小结 | 第70-72页 |
| 第五章 总结与展望 | 第72-75页 |
| 5.1 结论 | 第72-73页 |
| 5.2 展望 | 第73-75页 |
| 参考文献 | 第75-84页 |
| 致谢 | 第84-85页 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 | 第85页 |
