| 摘要 | 第4-6页 |
| abstract | 第6-8页 |
| 引言 | 第13-27页 |
| 1 鱼类溶菌酶的研究进展 | 第13-20页 |
| 1.1 鱼类g型溶菌酶（LYG） | 第13-15页 |
| 1.1.1 LYG分子生物学特征 | 第13-15页 |
| 1.1.2 LYG溶菌活性的影响因素 | 第15页 |
| 1.1.3 LYG的组织分布 | 第15页 |
| 1.2 鱼类c型溶菌酶 (LYC) | 第15-17页 |
| 1.2.1 LYC的分子生物学特征 | 第16页 |
| 1.2.2 LYC溶菌活性的影响因素 | 第16页 |
| 1.2.3 LYC的组织分布 | 第16-17页 |
| 1.3 鱼类溶菌酶的生物学作用 | 第17-19页 |
| 1.3.1 抑菌作用 | 第17-18页 |
| 1.3.2 免疫作用 | 第18页 |
| 1.3.3 抗病毒作用 | 第18页 |
| 1.3.4 协同作用 | 第18-19页 |
| 1.3.5 消化作用 | 第19页 |
| 1.4 溶菌酶的应用 | 第19-20页 |
| 1.4.1 免疫刺激剂 | 第19页 |
| 1.4.2 防腐剂 | 第19-20页 |
| 1.4.3 饲料添加剂 | 第20页 |
| 2 鱼类防御素（BD）的研究进展 | 第20-23页 |
| 2.1 BD的分子生物学特点 | 第21页 |
| 2.2 BD的组织分布 | 第21页 |
| 2.3 BD的生物学活性 | 第21-23页 |
| 2.3.1 抗菌作用 | 第21-22页 |
| 2.3.2 抗病毒作用 | 第22页 |
| 2.3.3 其他 | 第22-23页 |
| 3 毕赤酵母表达系统 | 第23-25页 |
| 3.1 构建多拷贝表达盒载体 | 第23-24页 |
| 3.2 在毕赤酵母中串联表达外源蛋白 | 第24-25页 |
| 3.3 鱼类溶菌酶和防御素在毕赤酵母中表达情况 | 第25页 |
| 4 本研究的目的与意义 | 第25-27页 |
| 第一章 鲤鱼g型溶菌酶的cDNA克隆及其与其他生物之间一级结构的比较 | 第27-39页 |
| 1.1 材料 | 第27-29页 |
| 1.1.1 材料、菌株和质粒 | 第27页 |
| 1.1.2 主要试剂 | 第27页 |
| 1.1.3 主要仪器 | 第27-28页 |
| 1.1.4 主要的试剂配制 | 第28页 |
| 1.1.5 主要培养基的配制 | 第28-29页 |
| 1.2 方法 | 第29-32页 |
| 1.2.1 鲤鱼鳃总RNA的提取 | 第29-30页 |
| 1.2.2 1st strand cDNA合成反应 | 第30页 |
| 1.2.3 鲤鱼g型溶菌酶基因的cDNA克隆 | 第30-31页 |
| 1.2.4 通过PCR添加酶切位点 | 第31-32页 |
| 1.2.5 序列分析及分子系统树的构建 | 第32页 |
| 1.3 结果 | 第32-37页 |
| 1.3.1 总RNA的提取结果 | 第32-33页 |
| 1.3.2 鲤鱼g型溶菌酶的cDNA克隆 | 第33-34页 |
| 1.3.3 对目的基因添加酶切位点的PCR扩增 | 第34-35页 |
| 1.3.4 CLYG序列 | 第35-36页 |
| 1.3.5 鲤鱼g型溶菌酶与其他生物之间一级结构的比较 | 第36-37页 |
| 1.3.6 基于鲤鱼和其他生物g型溶菌酶氨基酸序列的分子系统树分析 | 第37页 |
| 1.4 讨论 | 第37-39页 |
| 第二章 鲤鱼g型溶菌酶在毕赤酵母中的重组表达 | 第39-50页 |
| 2.1 材料 | 第39-41页 |
| 2.1.1 材料、菌株和质粒 | 第39页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第39页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第39页 |
| 2.1.4 主要的试剂配制 | 第39-40页 |
| 2.1.5 主要培养基的配制 | 第40-41页 |
| 2.2 方法 | 第41-45页 |
| 2.2.1 重组表达载体pPICZαA-CLYG的构建 | 第41-42页 |
| 2.2.2 重组表达载体pPICZαA-CLYG转化毕赤酵母X-33 | 第42-43页 |
| 2.2.3 高拷贝酵母转化子的筛选 | 第43-44页 |
| 2.2.4 阳性酵母转化子的鉴定 | 第44页 |
| 2.2.5 诱导表达CLYG | 第44页 |
| 2.2.6 Western blot分析 | 第44-45页 |
| 2.3 结果 | 第45-49页 |
| 2.3.1 重组表达载体pPICZαA-CLYG的构建 | 第45-46页 |
| 2.3.2 菌落PCR、双酶切及测序鉴定重组表达质粒pPICZαA-CLYG | 第46-47页 |
| 2.3.3 高拷贝酵母转化子的筛选 | 第47页 |
| 2.3.4 重组蛋白CLYG的SDS-PAGE分析 | 第47-48页 |
| 2.3.5 重组蛋白CLYG的Western blot分析 | 第48-49页 |
| 2.4 讨论 | 第49-50页 |
| 第三章 一种杂合抗菌肽多拷贝表达盒载体的构建及其在毕赤酵母中的表达 | 第50-75页 |
| 3.1 材料 | 第50-52页 |
| 3.1.1 菌株和质粒 | 第50页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第50页 |
| 3.1.3 主要仪器 | 第50页 |
| 3.1.4 主要的试剂配制 | 第50-51页 |
| 3.1.5 主要培养基的配制 | 第51-52页 |
| 3.2 方法 | 第52-60页 |
| 3.2.1 对斑马鱼防御素defbl3基因酶切位点和连接位点的添加 | 第52-53页 |
| 3.2.2 斑点叉尾鮰c型溶菌酶lyc基因的优化与合成 | 第53页 |
| 3.2.3 基于SOE-PCR的defbl3与lycl的cDNA串联 | 第53-55页 |
| 3.2.4 构建重组表达载体pPICZαA-LD | 第55-56页 |
| 3.2.5 构建二拷贝重组表达载体pPICZαA-LD_2 | 第56-57页 |
| 3.2.6 构建四拷贝重组表达载体pPICZαA-LD_4 | 第57页 |
| 3.2.7 多拷贝重组表达载体pPICZαA-LD_n转化筛选和拷贝数鉴定 | 第57-59页 |
| 3.2.8 甲醇诱导表达LD | 第59页 |
| 3.2.9 亲和层析法分离纯化重组蛋白LD | 第59-60页 |
| 3.2.10 抑菌实验 | 第60页 |
| 3.3 结果 | 第60-73页 |
| 3.3.1 添加酶切位点和连接位点的斑马鱼防御素defbl3基因 | 第60-61页 |
| 3.3.2 优化后的lycl核苷酸片段 | 第61页 |
| 3.3.3 串联基因LD | 第61-64页 |
| 3.3.4 重组表达载体pPICZαA-LD的鉴定 | 第64页 |
| 3.3.5 筛选和鉴定多拷贝表达载体pPICZαA-LD_n（n=2 或 4） | 第64-67页 |
| 3.3.6 多拷贝重组表达质粒pPICZαA-LD_n(n=1，2 或 4)转化毕赤酵母及阳性转化子的筛选 | 第67-68页 |
| 3.3.7 各拷贝阳性转化子诱导表达目的蛋白LD | 第68-70页 |
| 3.3.8 重组蛋白LD的纯化和Western blot检测 | 第70-71页 |
| 3.3.9 重组蛋白LD的抑菌活性 | 第71-73页 |
| 3.4 讨论 | 第73-75页 |
| 第四章 总结与展望 | 第75-76页 |
| 参考文献 | 第76-84页 |
| 致谢 | 第84页 |
