| 摘要 | 第8-10页 |
| ABSTRACT | 第10-11页 |
| 英文缩略表(Abbreviations) | 第12-14页 |
| 1 文献综述 | 第14-23页 |
| 1.1 牛呼吸道合胞病毒 | 第14-15页 |
| 1.2 牛呼吸道合胞病毒编码的蛋白 | 第15-18页 |
| 1.2.1 非结构蛋白NS1和NS2 | 第16页 |
| 1.2.2 疏水SH小蛋白 | 第16页 |
| 1.2.3 糖蛋白G | 第16-17页 |
| 1.2.4 融合F蛋白 | 第17-18页 |
| 1.3 牛呼吸道合胞病毒的流行病学 | 第18页 |
| 1.4 牛呼吸道合胞病毒疫苗的研究进展 | 第18-20页 |
| 1.4.1 灭活疫苗 | 第18页 |
| 1.4.2 亚单位合成疫苗 | 第18-19页 |
| 1.4.3 活病毒疫苗 | 第19-20页 |
| 1.4.4 病毒载体活疫苗 | 第20页 |
| 1.4.5 DNA疫苗 | 第20页 |
| 1.5 BHV-1病毒的概述 | 第20-21页 |
| 1.6 BHV-1的流行病学 | 第21页 |
| 1.7 BHV-1病毒活载体疫苗的研究进展 | 第21-23页 |
| 2 研究目的与意义 | 第23-24页 |
| 3 材料与方法 | 第24-38页 |
| 3.1 实验材料 | 第24-29页 |
| 3.1.1 菌种、细胞及毒株 | 第24页 |
| 3.1.2 载体与质粒 | 第24-26页 |
| 3.1.3 工具酶及主要试剂 | 第26页 |
| 3.1.4 主要培养基的配制 | 第26页 |
| 3.1.5 主要缓冲液 | 第26-27页 |
| 3.1.5.1 质粒提取缓冲液 | 第26页 |
| 3.1.5.2 SDS-PAGE电泳缓冲液 | 第26-27页 |
| 3.1.5.3 Western blot缓冲液 | 第27页 |
| 3.1.5.4 蛋白纯化缓冲液 | 第27页 |
| 3.1.6 空斑纯化试剂 | 第27-28页 |
| 3.1.7 ELISA缓冲液 | 第28页 |
| 3.1.8 其他溶液 | 第28-29页 |
| 3.1.9 本研究所用引物 | 第29页 |
| 3.1.10 试验动物及试验地点 | 第29页 |
| 3.2 实验方法 | 第29-38页 |
| 3.2.1 病毒增殖 | 第29页 |
| 3.2.2 限制性内切酶酶切反应 | 第29页 |
| 3.2.3 PCR或酶切产物琼脂糖凝胶电泳检测 | 第29-30页 |
| 3.2.4 PCR或酶切产物的回收与纯化 | 第30页 |
| 3.2.5 外源DNA片段与载体的连接反应 | 第30页 |
| 3.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) | 第30页 |
| 3.2.7 连接产物的转化 | 第30-31页 |
| 3.2.8 重组质粒的小量制备(OMEGA质粒小提试剂盒) | 第31页 |
| 3.2.9 重组质粒的大量制备(OMEGA质粒大提试剂盒) | 第31-32页 |
| 3.2.10 诱导表达 | 第32页 |
| 3.2.11 表达蛋白的分析和纯化 | 第32页 |
| 3.2.12 表达蛋白的多抗制备 | 第32页 |
| 3.2.13 间接ELISA确定表达蛋白的最佳包被浓度 | 第32-33页 |
| 3.2.14 病毒基因组的大量提取 | 第33页 |
| 3.2.15 脂质体介导的共转染 | 第33-34页 |
| 3.2.16 空斑挑取及纯化 | 第34页 |
| 3.2.17 病毒基因的小量提取 | 第34页 |
| 3.2.18 病毒基因组PCR鉴定 | 第34-35页 |
| 3.2.19 间接免疫荧光试验(IFA)检测目的蛋白的表达 | 第35页 |
| 3.2.20 Western blot检测目的蛋白的表达 | 第35-36页 |
| 3.2.20.1 样品的处理 | 第35页 |
| 3.2.20.2 SDS-PAGE电泳 | 第35-36页 |
| 3.2.20.3 Western blot检测 | 第36页 |
| 3.2.21 病毒TCID50的测定 | 第36页 |
| 3.2.22 一步法增殖曲线 | 第36页 |
| 3.2.23 动物试验 | 第36-38页 |
| 3.2.23.1 重组牛疱疹病毒BHV-1TK~-/gG~(-/)gE~-/BRSVG~+的动物试验 | 第36-37页 |
| 3.2.23.2 动物试验鼻拭子的检测 | 第37页 |
| 3.2.23.3 动物试验血清ELISA抗体检测 | 第37页 |
| 3.2.23.4 动物试验血清中和抗体检测 | 第37-38页 |
| 4 结果与分析 | 第38-52页 |
| 4.1 BRSV G基因的原核表达以及间接ELISA抗原最佳包被浓度的确定 | 第38-42页 |
| 4.1.1 原核表达质粒pET-30a-mG的构建 | 第38-39页 |
| 4.1.2 BRSV mG蛋白的原核表达 | 第39页 |
| 4.1.3 mG蛋白的纯化 | 第39-40页 |
| 4.1.4 mG蛋白的westernblot鉴定 | 第40-41页 |
| 4.1.5 兔多抗的制备及检测 | 第41-42页 |
| 4.1.6 mG-ELISA检测确定mG蛋白的最佳包被浓度 | 第42页 |
| 4.2 重组病毒BHV-1TK~-/gG~-/gE~-/BSRVG~+的构建 | 第42-49页 |
| 4.2.1 中间转移载体pSK-b actin-BGH-CMV-SV40的构建 | 第42页 |
| 4.2.2 转移载体pSKBgEpCA.G的构建 | 第42-44页 |
| 4.2.3 重组病毒BHV-1TK~-/gG~-/gE~-/BSRVG~+的构建与初步鉴定 | 第44-45页 |
| 4.2.4 重组病毒BHV-1 TK~-/gG~-/gE~-/BRSVG~+的PCR鉴定与空斑纯化 | 第45-47页 |
| 4.2.5 重组病毒BHV-1 TK~-/gG~-/gE~-/BRSVG~+外源基因表达的检测 | 第47-48页 |
| 4.2.5.1 重组病毒BHV-1 TK~-/gG~-/gE~-/BRSVG~+的间接免疫荧光检测 | 第47页 |
| 4.2.5.2 重组病毒BHV-1 TK~-/gG~-/gE~-/BRSVG~+的western blot检测 | 第47-48页 |
| 4.2.6 重组病毒BHV-1 TK~-/gG~-/gE~-/BRSVG~+的遗传稳定性检测 | 第48-49页 |
| 4.2.7 重组病毒BHV-1 TK~-/gG~-/gE~-/BRSVG~+一步法生长曲线 | 第49页 |
| 4.3 重组病毒BHV-1 TK~-/gG~-/gE~-/BRSVG+免疫原性的初步研究 | 第49-52页 |
| 4.3.1 兔鼻拭子的排毒情况检测 | 第49-50页 |
| 4.3.2 ELISA检测兔血清中的BRSV抗体水平 | 第50页 |
| 4.3.3 中和试验检测兔血清中的BHV-1中和抗体水平 | 第50-52页 |
| 5 讨论与结论 | 第52-55页 |
| 5.1 讨论 | 第52-54页 |
| 5.1.1 BRSV.G蛋白的表达 | 第52页 |
| 5.1.2 疱疹病毒Ⅰ型载体的选择 | 第52页 |
| 5.1.3 重组病毒的构建和动物实验 | 第52-54页 |
| 5.2 结论 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-61页 |
| 致谢 | 第61页 |
