| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第11-31页 |
| 1.1 生物质资源的研究现状 | 第11-18页 |
| 1.1.1 纤维素 | 第11-14页 |
| 1.1.2 半纤维素 | 第14-18页 |
| 1.2 大肠杆菌表达系统及其研究进展 | 第18-21页 |
| 1.2.1 大肠杆菌表达系统在基因工程中的应用 | 第18-19页 |
| 1.2.2 常用的大肠杆菌表达载体 | 第19-20页 |
| 1.2.3 pHsh系统 | 第20-21页 |
| 1.3 厌氧技术简介 | 第21-26页 |
| 1.3.1 气体除氧 | 第21-22页 |
| 1.3.2 厌氧培养瓶和试管 | 第22-24页 |
| 1.3.3 厌氧菌的固体培养基 | 第24页 |
| 1.3.4 厌氧微生物的培养 | 第24-25页 |
| 1.3.5 厌氧微生物的菌种保藏 | 第25-26页 |
| 1.4 外源蛋白在大肠杆菌中表达形成包涵体 | 第26-27页 |
| 1.4.1 大肠杆菌中高效表达的策略 | 第26页 |
| 1.4.2 外源蛋白在大肠杆菌中表达形成包涵体 | 第26-27页 |
| 1.5 本研究的立题依据、目的和意义及主要内容 | 第27-31页 |
| 1.5.1 立题依据 | 第27-28页 |
| 1.5.2 研究目的和意义 | 第28-30页 |
| 1.5.3 主要研究内容 | 第30-31页 |
| 第二章 利用pHsh高效表达耐热纤维素酶 | 第31-57页 |
| 2.1 材料 | 第31-36页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第31页 |
| 2.1.2 培养基 | 第31-33页 |
| 2.1.3 培养条件 | 第33-34页 |
| 2.1.4 主要试剂及其来源 | 第34-35页 |
| 2.1.5 主要设备及其来源 | 第35-36页 |
| 2.1.6 DNA引物合成和DNA测序服务 | 第36页 |
| 2.2 方法 | 第36-45页 |
| 2.2.1 热纤梭菌(C. thermocellum ATCC 27405)厌氧瓶液体培养 | 第36页 |
| 2.2.2 热纤梭菌(C. thermocellum ATCC 27405)基因组DNA的提取 | 第36页 |
| 2.2.3 感受态细胞的制备 | 第36-37页 |
| 2.2.4 电转化 | 第37页 |
| 2.2.5 DNA酶切、连接及磷酸化反应、核酸浓缩 | 第37页 |
| 2.2.6 碱变性法抽提质粒 | 第37-38页 |
| 2.2.7 热纤梭菌(C.thermocellum ATCC 27405)来源的纤维素酶基因的克隆 | 第38页 |
| 2.2.8 重组表达质粒pHsh-celD mRNA二级结构的优化 | 第38-39页 |
| 2.2.9 重组表达质粒pHsh-celD Ⅰ N端密码子的优化 | 第39-40页 |
| 2.2.10 重组菌的培养及重组酶的诱导表达 | 第40页 |
| 2.2.11 重组纤维素酶的分离纯化 | 第40-41页 |
| 2.2.12 Bradford法测定蛋白浓度 | 第41-42页 |
| 2.2.13 聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第42-43页 |
| 2.2.14 纤维素酶酶活的测定 | 第43-44页 |
| 2.2.15 重组纤维素酶的性质分析 | 第44-45页 |
| 2.3 结果与分析 | 第45-54页 |
| 2.3.1 纤维素酶序列分析及克隆 | 第45-47页 |
| 2.3.2 重组表达质粒二级结构的优化 | 第47-48页 |
| 2.3.3 重组表达质粒pHsh-celD Ⅰ N端密码子的优化 | 第48-50页 |
| 2.3.4 重组纤维素酶的表达及检测 | 第50-51页 |
| 2.3.5 重组纤维素酶的酶活检测 | 第51-52页 |
| 2.3.6 重组纤维素酶的酶学性质 | 第52-54页 |
| 2.4 讨论 | 第54-57页 |
| 第三章 多功能半纤维素酶的构建及其应用研究 | 第57-81页 |
| 3.1 材料 | 第57-60页 |
| 3.1.1 菌株与质粒 | 第57页 |
| 3.1.2 培养基 | 第57页 |
| 3.1.3 培养条件 | 第57-58页 |
| 3.1.4 主要试剂及其来源 | 第58-59页 |
| 3.1.5 主要仪器设备及其来源 | 第59-60页 |
| 3.1.6 DNA引物合成和DNA测序服务 | 第60页 |
| 3.2 方法 | 第60-68页 |
| 3.2.1 T. ethanolicus JW200厌氧瓶液体培养 | 第60页 |
| 3.2.2 T. ethanolicus JW200基因组的提取 | 第60-61页 |
| 3.2.3 大肠杆菌相关的实验方法 | 第61页 |
| 3.2.4 重组质粒的构建 | 第61-62页 |
| 3.2.5 重组菌的培养及重组酶的诱导表达 | 第62-63页 |
| 3.2.6 蛋白质浓度的测定及SDS-PAGE凝胶电泳 | 第63页 |
| 3.2.7 Ni-NTA Agarose亲和层析纯化 | 第63页 |
| 3.2.8 活性着色Xyn-SDS-PAGE | 第63页 |
| 3.2.9 木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶和木聚糖酶活性测定 | 第63-65页 |
| 3.2.10 游离酶及融合酶的酶学性质测定及动力学参数测定 | 第65-66页 |
| 3.2.11 游离酶及融合酶的酶解实验 | 第66-67页 |
| 3.2.12 DNS法检测还原糖 | 第67-68页 |
| 3.3 结果与分析 | 第68-79页 |
| 3.3.1 T.ethanolicus JW200基因组的提取 | 第68页 |
| 3.3.2 重组质粒的构建 | 第68-72页 |
| 3.3.3 游离酶与融合酶的表达以及纯化 | 第72-73页 |
| 3.3.4 活性着色Xyn-SDS-PAGE分析 | 第73-74页 |
| 3.3.5 游离酶与融合酶的酶学性质分析 | 第74-78页 |
| 3.3.6 融合酶的酶解实验 | 第78-79页 |
| 3.4 讨论 | 第79-81页 |
| 第四章 利用pHsh-ex系统可溶性高效表达半纤维素酶的研究 | 第81-102页 |
| 4.1 材料 | 第81-84页 |
| 4.1.1 菌株与质粒 | 第81页 |
| 4.1.2 培养基及培养条件 | 第81-82页 |
| 4.1.3 主要试剂及其来源 | 第82-83页 |
| 4.1.4 主要仪器设备及其来源 | 第83-84页 |
| 4.1.5 DNA引物合成和DNA测序服务 | 第84页 |
| 4.2 方法 | 第84-88页 |
| 4.2.1 一般基因操作方法 | 第84页 |
| 4.2.2 重组质粒的构建 | 第84-86页 |
| 4.2.3 重组质粒的诱导表达 | 第86-87页 |
| 4.2.4 周质空间蛋白的提取方法 | 第87页 |
| 4.2.5 DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析 | 第87页 |
| 4.2.6 重组酶的测定方法 | 第87页 |
| 4.2.7 蛋白质浓度的测定及SDS-PAGE凝胶电泳 | 第87-88页 |
| 4.3 结果与分析 | 第88-98页 |
| 4.3.1 重组质粒的构建 | 第88-94页 |
| 4.3.2 重组质粒的诱导表达 | 第94-98页 |
| 4.4 讨论 | 第98-102页 |
| 第五章 结论 | 第102-104页 |
| 参考文献 | 第104-113页 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 | 第113-115页 |
| 致谢 | 第115页 |
