| 摘要 | 第9-10页 |
| ABSTRACT | 第10页 |
| 英文缩略词表 | 第11-12页 |
| 前言 | 第12-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-23页 |
| 1 黄嘌呤氧化酶 | 第13-16页 |
| 1.1 XOD的结构 | 第13页 |
| 1.2 XOD在机体的分布 | 第13页 |
| 1.3 XOD的应用 | 第13-15页 |
| 1.3.1 XOD的生理功能 | 第13-14页 |
| 1.3.2 XOD的先天免疫作用 | 第14页 |
| 1.3.3 检测SOD活力 | 第14页 |
| 1.3.4 测定血清中无机磷 | 第14-15页 |
| 1.3.5 提高利巴韦林的转化率 | 第15页 |
| 1.3.6 鱼类新鲜度的测定 | 第15页 |
| 1.4 XOD相关的研究进展 | 第15-16页 |
| 1.4.1 XOD与疾病 | 第15页 |
| 1.4.2 XOD抑制剂的开发 | 第15-16页 |
| 1.4.3 XOD合成菌的选育 | 第16页 |
| 1.4.4 XOD的纯化 | 第16页 |
| 2 原核表达系统概述 | 第16-19页 |
| 2.1 大肠杆菌表达载体的调控原件 | 第16-17页 |
| 2.2 大肠杆菌表达载体的类型 | 第17-19页 |
| 2.2.1 非融合表达载体 | 第17页 |
| 2.2.2 融合表达载体 | 第17-18页 |
| 2.2.3 分泌表达载体 | 第18页 |
| 2.2.4 表面呈现表达载体 | 第18页 |
| 2.2.5 带伴侣蛋白的表达载体 | 第18-19页 |
| 2.3 外源目的蛋白的表达形式 | 第19页 |
| 3 禽IB的研究进展 | 第19-21页 |
| 3.1 IBV的分型 | 第19-20页 |
| 3.1.1 NIBV感染后的临床症状 | 第19页 |
| 3.1.2 NIBV感染后的病理变化 | 第19-20页 |
| 3.2 IB的预防与治疗 | 第20-21页 |
| 3.2.1 IB的预防 | 第20页 |
| 3.2.2 IB的治疗 | 第20-21页 |
| 4 本研究的目的和意义 | 第21页 |
| 5 研究内容与试验流程 | 第21-23页 |
| 5.1 研究内容 | 第21-22页 |
| 5.2 试验流程 | 第22-23页 |
| 第二章 鸡XOD的原核表达 | 第23-42页 |
| 1 材料与方法 | 第23-26页 |
| 1.1 主要试剂 | 第23-24页 |
| 1.2 主要仪器设备 | 第24页 |
| 1.3 试剂、培养基的制备 | 第24页 |
| 1.4 琼脂糖凝胶电泳所需试剂的制备 | 第24-25页 |
| 1.5 SDS-PAGE试剂配制 | 第25页 |
| 1.6 纯化试剂配制 | 第25-26页 |
| 1.7 蛋白透析复性液的配制 | 第26页 |
| 1.7.1 透析袋处理液 | 第26页 |
| 1.7.2 透析复性液 | 第26页 |
| 2 实验方法 | 第26-32页 |
| 2.1 鸡XOD的生物信息学分析 | 第26页 |
| 2.1.1 鸡XOD信号肽位点的预测分析 | 第26页 |
| 2.1.2 鸡XOD抗原肽端分析 | 第26页 |
| 2.1.3 鸡XOD基因的稀有密码子分析 | 第26页 |
| 2.2 克隆质粒PMD-XOD的构建 | 第26-29页 |
| 2.2.1 引物的设计 | 第26-27页 |
| 2.2.2 鸡肝组织RNA的提取 | 第27页 |
| 2.2.3 cDNA的合成 | 第27页 |
| 2.2.4 XOD基因的PCR扩增 | 第27页 |
| 2.2.5 XOD基因产物的纯化 | 第27页 |
| 2.2.6 XOD基因的克隆 | 第27-28页 |
| 2.2.7 连接产物的转化 | 第28页 |
| 2.2.8 克隆菌株的筛选和鉴定 | 第28-29页 |
| 2.3 表达载体pET-XOD的构建 | 第29-30页 |
| 2.3.1 原核表达载体和XOD基因的制备 | 第29页 |
| 2.3.2 XOD基因与表达载体的连接 | 第29页 |
| 2.3.3 连接产物的转化 | 第29页 |
| 2.3.4 表达菌株的筛选和鉴定 | 第29-30页 |
| 2.4 目的蛋白的诱导表达 | 第30页 |
| 2.4.1 目的蛋白的诱导表达 | 第30页 |
| 2.4.2 目的蛋白的大量表达 | 第30页 |
| 2.4.3 目的蛋白表达形式的鉴定 | 第30页 |
| 2.5 目的蛋白纯化、复性及浓缩 | 第30-31页 |
| 2.5.1 蛋白纯化条件的优化 | 第30-31页 |
| 2.5.2 目的蛋白透析复性及浓缩 | 第31页 |
| 2.6 SDS-PAGE分析 | 第31-32页 |
| 3 结果与分析 | 第32-40页 |
| 3.1 鸡XOD的生物信息学分析结果 | 第32-33页 |
| 3.1.1 鸡XOD信号肽端的预测分析结果 | 第32-33页 |
| 3.1.2 鸡XOD抗原肽端分析 | 第33页 |
| 3.1.3 鸡XOD基因的稀有密码子分析结果 | 第33页 |
| 3.2 克隆载体PMD-XOD的构建 | 第33-34页 |
| 3.2.1 XOD基因的扩增 | 第33页 |
| 3.2.2 克隆载体PMD-XOD的筛选和鉴定 | 第33-34页 |
| 3.3 表达质粒pET-XOD的构建 | 第34-37页 |
| 3.3.1 原核表达载体及XOD基因的制备 | 第34-35页 |
| 3.3.2 pET-XOD载体的筛选和鉴定 | 第35-37页 |
| 3.4 重组蛋白的表达 | 第37-40页 |
| 3.4.1 重组蛋白的IPTG诱导表达 | 第37页 |
| 3.4.2 重组蛋白表达形式的鉴定 | 第37-38页 |
| 3.4.3 包涵体的溶解鉴定 | 第38-39页 |
| 3.4.4 咪唑浓度优化 | 第39页 |
| 3.4.5 蛋白复性浓缩后的SDS-PAGE鉴定 | 第39-40页 |
| 4 讨论 | 第40-42页 |
| 4.1 XOD目的表达区域基因的获取 | 第40页 |
| 4.2 表达系统的构建 | 第40-41页 |
| 4.2.1 表达系统的选择 | 第40-41页 |
| 4.2.2 表达载体的选择 | 第41页 |
| 4.3 重组XOD蛋白的纯化 | 第41-42页 |
| 第三章 鸡XOD多克隆抗体的制备 | 第42-50页 |
| 1 材料与方法 | 第42-43页 |
| 1.1 试验材料 | 第42页 |
| 1.2 主要仪器 | 第42页 |
| 1.3 ELISA试剂配制 | 第42-43页 |
| 1.4 Western Blot试剂配制 | 第43页 |
| 2 实验方法 | 第43-45页 |
| 2.1 家兔免疫 | 第43-44页 |
| 2.2 ELISA方法检测抗体的效价 | 第44-45页 |
| 2.2.1 最佳抗原包被浓度及抗体稀释倍数的确定 | 第44页 |
| 2.2.2 抗体效价的确定 | 第44-45页 |
| 2.3 Western Blot分析 | 第45页 |
| 2.3.1 鸡肝组织总蛋白的提取 | 第45页 |
| 2.3.2 鸡肝组织蛋白的Western Blot检测 | 第45页 |
| 3 结果与分析 | 第45-47页 |
| 3.1 最佳抗原包被浓度及抗体稀释度的确定 | 第45-46页 |
| 3.2 抗体效价的确定 | 第46-47页 |
| 3.3 Western Blot检测鸡肝组织总蛋白中的XOD | 第47页 |
| 4 讨论 | 第47-50页 |
| 4.1 重组鸡XOD蛋白多克隆抗体血清的制备 | 第47-48页 |
| 4.2 间接ELISA方法测定抗体效价 | 第48页 |
| 4.3 Western blot鉴定抗体特异性 | 第48-50页 |
| 第四章 鸡XOD在肝、肾组织中的定位分析 | 第50-55页 |
| 1 材料与方法 | 第50页 |
| 1.1 试验材料 | 第50页 |
| 1.2 主要仪器 | 第50页 |
| 1.3 试剂的配制 | 第50页 |
| 2 试验方法 | 第50-51页 |
| 2.1 免疫组化检测 | 第50-51页 |
| 2.2 免疫荧光检测 | 第51页 |
| 3 结果与分析 | 第51-53页 |
| 3.1 免疫组化检测XOD分布 | 第52-53页 |
| 3.2 免疫荧光检测XOD分布 | 第53页 |
| 4 讨论 | 第53-55页 |
| 4.1 鸡肝肾组织中XOD的定位 | 第53-54页 |
| 4.2 免疫组化和免疫荧光的优缺点 | 第54-55页 |
| 第五章 鸡NIBV感染后肾XOD及BCL-2 的蛋白表达量分析 | 第55-61页 |
| 1 材料与方法 | 第55-56页 |
| 1.1 试验材料 | 第55页 |
| 1.2 主要仪器 | 第55页 |
| 1.3 试剂配制 | 第55-56页 |
| 2 试验方法 | 第56-58页 |
| 2.1 试验动物攻毒 | 第56页 |
| 2.2 鸡肾组织采集 | 第56页 |
| 2.3 鸡肾组织蛋白的提取 | 第56-57页 |
| 2.4 鸡肾组织蛋白浓度的测定 | 第57-58页 |
| 2.4.1 BSA标准品的稀释 | 第57页 |
| 2.4.1 定量检测蛋白浓度 | 第57页 |
| 2.4.2 Western Blot相对定量分析 | 第57-58页 |
| 2.5 数据分析 | 第58页 |
| 3 结果与分析 | 第58-59页 |
| 3.1 临床症状和剖检情况 | 第58页 |
| 3.2 肾组织总蛋白的浓度的测定 | 第58-59页 |
| 3.3 XOD及Bcl-2 蛋白表达的相对定量 | 第59页 |
| 4 讨论 | 第59-61页 |
| 全文总结 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-67页 |
| 致谢 | 第67-68页 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 | 第68页 |
