| 致谢 | 第6-8页 |
| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 第一章 引言 | 第17-58页 |
| 1.1 microRNA的发现与生物学特性 | 第17-18页 |
| 1.2 microRNA的形成与作用机理 | 第18-21页 |
| 1.3 microRNA的预测与鉴定 | 第21-22页 |
| 1.4 microRNA靶基因的预测与鉴定 | 第22-29页 |
| 1.4.1 生物信息学预测法 | 第23-25页 |
| 1.4.2 miRNA靶标预测软件 | 第25-28页 |
| 1.4.3 生物学实验鉴定法 | 第28-29页 |
| 1.5 microRNA调控靶基因的特点 | 第29页 |
| 1.6 microRNA表达的调控 | 第29-34页 |
| 1.6.1 表观遗传学调控 | 第30-31页 |
| 1.6.2 转录水平的调控 | 第31-32页 |
| 1.6.3 转录后水平的调控 | 第32页 |
| 1.6.4 降解的调控 | 第32-33页 |
| 1.6.5 竞争性内源RNA对miRNA的调控 | 第33-34页 |
| 1.7 microRNA的生物学功能 | 第34-52页 |
| 1.7.1 miRNA与胚胎早期发育 | 第36页 |
| 1.7.2 miRNA与背腹轴图式形成 | 第36-37页 |
| 1.7.3 miRNA与神经系统发育 | 第37-40页 |
| 1.7.4 miRNA与心血管系统发育 | 第40-42页 |
| 1.7.5 miRNA与细胞生长分化和凋亡 | 第42-45页 |
| 1.7.6 miRNA与免疫应答 | 第45-47页 |
| 1.7.7 miRNA与肿瘤癌症 | 第47-52页 |
| 1.8 miRNA可能参与了多功能基因转录后调控 | 第52页 |
| 1.9 多功能基因vsx1的3'-UTR具有介导组织特异性表达的功能 | 第52-56页 |
| 1.10 本研究的意义与目的 | 第56-58页 |
| 第二章 vsx1是miR-20a的一个靶基因 | 第58-98页 |
| 2.1 前言 | 第58-59页 |
| 2.2 材料与方法 | 第59-79页 |
| 2.2.1 溶液配制 | 第59-62页 |
| 2.2.2 金鱼和斑马鱼的饲养及胚胎获得 | 第62页 |
| 2.2.3 受精卵去膜 | 第62-63页 |
| 2.2.4 不同时期胚胎的观察、记录和收集 | 第63页 |
| 2.2.5 miRNA的靶标预测 | 第63-64页 |
| 2.2.6 GFP报告基因载体的构建 | 第64-65页 |
| 2.2.7 无内毒素质粒提取 | 第65-66页 |
| 2.2.8 antagomir和agomir的合成 | 第66-67页 |
| 2.2.9 显微注射及注射后胚胎的培养 | 第67-68页 |
| 2.2.10 免疫组化 | 第68-69页 |
| 2.2.11 胚胎Total RNA的提取 | 第69-70页 |
| 2.2.12 Total RNA中残留基因组DNA的处理 | 第70-71页 |
| 2.2.13 RNA逆转录合成cDNA | 第71页 |
| 2.2.14 mRNA实时定量荧光PCR | 第71-72页 |
| 2.2.15 反义RNA探针制备和纯化 | 第72-77页 |
| 2.2.15.1 重组质粒构建 | 第73-76页 |
| 2.2.15.2 重组质粒线性化 | 第76页 |
| 2.2.15.3 反义RNA探针体外合成 | 第76-77页 |
| 2.2.15.4 反义RNA探针纯化 | 第77页 |
| 2.2.16 整胚原位杂交 | 第77-79页 |
| 2.2.16.1 胚胎固定和脱水 | 第77-78页 |
| 2.2.16.2 胚胎复水和探针杂交 | 第78页 |
| 2.2.16.3 探针洗脱及抗体孵育 | 第78-79页 |
| 2.2.16.4 抗体洗脱与NBT/BCIP显色 | 第79页 |
| 2.3 实验结果 | 第79-96页 |
| 2.3.1 vsx1 3'-UTR上miRNA潜在结合位点的预测和模拟 | 第79-85页 |
| 2.3.2 miR-20a能直接结合到vsx1A1的3'-UTR上调控蛋白表达 | 第85-89页 |
| 2.3.3 miRNA靶位点的识别与vsx1A1 3'-UTR的二级结构准入性有关 | 第89-91页 |
| 2.3.4 miR-20a能有效抑制斑马鱼内源Vsx1蛋白的表达 | 第91-92页 |
| 2.3.5 miR-20a主要通过诱导内源vsx1 mRNA的降解来阻遏其表达 | 第92-93页 |
| 2.3.6 miR-20a在活体胚胎中作用于vsx1 mRNA的特异性 | 第93-96页 |
| 2.4 实验小结 | 第96-98页 |
| 第三章 miR-20a对vsx1表达的转录后调控是鱼类正常胚胎发育所必须的 | 第98-116页 |
| 3.1 前言 | 第98页 |
| 3.2 材料与方法 | 第98-106页 |
| 3.2.1 溶液配制 | 第98-100页 |
| 3.2.2 显微注射 | 第100页 |
| 3.2.3 胚胎Total miRNA的提取 | 第100-101页 |
| 3.2.4 高通量测序 | 第101页 |
| 3.2.5 miRNA逆转录合成cDNA | 第101-102页 |
| 3.2.6 miRNA实时定量PCR | 第102页 |
| 3.2.7 miRNA的整胚原位杂交 | 第102-103页 |
| 3.2.8 冰冻切片的准备 | 第103页 |
| 3.2.9 冰冻切片的miRNA原位杂交 | 第103-105页 |
| 3.2.9.1 LNA miRNA探针杂交 | 第104页 |
| 3.2.9.2 探针洗脱及抗体孵育 | 第104-105页 |
| 3.2.9.3 抗体洗脱与NBT/BCIP显色 | 第105页 |
| 3.2.10 免疫荧光 | 第105-106页 |
| 3.3 实验结果 | 第106-114页 |
| 3.3.1 miR-20a在金鱼中的表达 | 第106-107页 |
| 3.3.2 miR-20a在金鱼中的时空表达模式 | 第107-109页 |
| 3.3.3 miR-20a在斑马鱼中的时空表达模式与金鱼基本一致 | 第109-110页 |
| 3.3.4 提示miR-20a在建立正确的Vsx1蛋白表达时空模式中起关键作用 | 第110-112页 |
| 3.3.5 miR-20a通过抑制vsx1的异位表达在胚胎发育和神经发生过程中发挥关键调控作用 | 第112-114页 |
| 3.4 实验小结 | 第114-116页 |
| 第四章 主要结果和进一步研究设想 | 第116-120页 |
| 4.1 主要研究结果和结论 | 第116-117页 |
| 4.2 讨论与进一步研究设想 | 第117-120页 |
| 参考文献 | 第120-148页 |
| 作者简历 | 第148页 |
