| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 1 引言 | 第12-20页 |
| 1.1 BHV-1概述 | 第12-13页 |
| 1.2 Toll样受体 | 第13-15页 |
| 1.2.1 TLR2研究进展 | 第13-14页 |
| 1.2.2 TLR9研究进展 | 第14-15页 |
| 1.3 RNAi的概述 | 第15-16页 |
| 1.4 RNAi的作用及意义 | 第16-17页 |
| 1.5 细胞因子 | 第17-19页 |
| 1.5.1 IL-6的生物学功能 | 第17-18页 |
| 1.5.2 TNF-α的生物学功能 | 第18页 |
| 1.5.3 IFN-β的生物学功能 | 第18-19页 |
| 1.6 研究的目的及意义 | 第19-20页 |
| 2 试验一 siRNA干扰片段的筛选及沉默效果的鉴定 | 第20-35页 |
| 2.1 材料 | 第20页 |
| 2.1.1 细胞及试验试剂 | 第20页 |
| 2.1.2 主要试验器材 | 第20页 |
| 2.1.3 主要液体的配置 | 第20页 |
| 2.2 方法 | 第20-25页 |
| 2.2.1 细胞的复苏及培养 | 第21页 |
| 2.2.2 定量RT-PCR引物的设计与合成 | 第21页 |
| 2.2.3 siRNA-TLR2与siRNA-TLR9的设计、合成 | 第21-22页 |
| 2.2.4 EBTr细胞转染效率的测定 | 第22-23页 |
| 2.2.5 检测TLR2和TLR9定量RT-PCR方法的建立 | 第23页 |
| 2.2.6 分组转染siRNA-TLR2和siRNA-TLR9片段 | 第23页 |
| 2.2.7 总RNA的提取 | 第23-24页 |
| 2.2.8 反转录 | 第24-25页 |
| 2.2.9 干扰片段的筛选 | 第25页 |
| 2.2.10 沉默效果的鉴定 | 第25页 |
| 2.2.11 数据处理 | 第25页 |
| 2.3 结果 | 第25-33页 |
| 2.3.1 测定阳性样品的转染效率 | 第25-27页 |
| 2.3.2 建立标准曲线 | 第27-30页 |
| 2.3.3 siRNA片段的筛选 | 第30-31页 |
| 2.3.4 不同时间点的相对表达量归一化值 | 第31-33页 |
| 2.4 讨论 | 第33-34页 |
| 2.5 小结 | 第34-35页 |
| 3 试验二 靶向TLR2或TLR9基因的siRNA对BHV-1增殖规律的影响 | 第35-44页 |
| 3.1 材料 | 第35页 |
| 3.1.1 主要试剂 | 第35页 |
| 3.1.2 试验细胞和病毒 | 第35页 |
| 3.2 方法 | 第35-38页 |
| 3.2.1 引物和探针的设计与合成 | 第35页 |
| 3.2.2 细胞培养 | 第35-36页 |
| 3.2.3 BHV-1病毒的稀释 | 第36页 |
| 3.2.4 TaqMan荧光定量PCR检测BHV-1 | 第36页 |
| 3.2.5 siRNA干扰和感染BHV-1 | 第36-37页 |
| 3.2.6 BHV-1 DNA的提取 | 第37页 |
| 3.2.7 BHV-1增殖规律的检测 | 第37-38页 |
| 3.2.8 观察不同时间点的细胞病变情况 | 第38页 |
| 3.2.9 数据处理 | 第38页 |
| 3.3 结果 | 第38-41页 |
| 3.3.1 检测BHV-1定量PCR的标准曲线 | 第38-39页 |
| 3.3.2 BHV-1的增殖规律 | 第39页 |
| 3.3.3 出现CPE情况 | 第39-41页 |
| 3.4 讨论 | 第41-43页 |
| 3.5 小结 | 第43-44页 |
| 4 试验三 沉默TLR2和TLR9后感染BHV-1对EBTr细胞的IL-6、TNF-α和IFN-β的影响 | 第44-60页 |
| 4.1 材料 | 第44页 |
| 4.1.1 细胞及病毒 | 第44页 |
| 4.1.2 主要试验试剂 | 第44页 |
| 4.1.3 主要试验器材 | 第44页 |
| 4.2 方法 | 第44-49页 |
| 4.2.1 细胞的培养 | 第44页 |
| 4.2.2 病毒的培养及稀释 | 第44-45页 |
| 4.2.3 引物的设计与合成 | 第45页 |
| 4.2.4 总RNA提取 | 第45页 |
| 4.2.5 反转录 | 第45-46页 |
| 4.2.6 各细胞因子片段的胶回收与纯化 | 第46页 |
| 4.2.7 目的基因的连接与重组质粒的转化 | 第46-47页 |
| 4.2.8 IL-6、TNF-α和IFN-β标准曲线的建立 | 第47-48页 |
| 4.2.9 细胞的分组处理 | 第48页 |
| 4.2.10 总RNA提取和cDNA合成 | 第48页 |
| 4.2.11 定量PCR检测各细胞因子mRNA水平的表达 | 第48-49页 |
| 4.2.12 统计学分析 | 第49页 |
| 4.3 结果 | 第49-55页 |
| 4.3.1 各细胞因子的目的基因PCR扩增结果 | 第49-50页 |
| 4.3.2 质粒PCR鉴定 | 第50页 |
| 4.3.3 基因测序结果 | 第50页 |
| 4.3.4 标准曲线的建立 | 第50-55页 |
| 4.3.5 不同处理组的检测结果 | 第55页 |
| 4.4 讨论 | 第55-59页 |
| 4.5 小结 | 第59-60页 |
| 5 结论 | 第60-61页 |
| 致谢 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-72页 |
| 作者简介 | 第72页 |
