| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-10页 |
| 英文缩略语 | 第10-14页 |
| 第一部分 CD47及其配体SIRPα 与肿瘤的相关性 | 第14-27页 |
| 1 CD47的生物学作用 | 第14-16页 |
| ·CD47的基本特征 | 第14-15页 |
| ·CD47的主要配体和生物学功能 | 第15页 |
| ·CD47与T细胞之间的相互作用 | 第15-16页 |
| 2 SIRPα 的生物学作用 | 第16页 |
| 3 CD47和SIRPα 的表达 | 第16-17页 |
| 4 CD47-SIRPα 相互作用及信号通路 | 第17-19页 |
| ·CD47-SIRPα 相互作用 | 第17-18页 |
| ·CD47-SIRPα 信号通路 | 第18页 |
| ·CD47- SIRPα 信号通路在肿瘤免疫逃逸中的作用 | 第18-19页 |
| 5 靶向CD47抗肿瘤免疫治疗的研究进展 | 第19-21页 |
| ·靶向CD47的抗体作用的主要机制 | 第19-20页 |
| ·靶向CD47的抗体作用于肿瘤的选择性 | 第20页 |
| ·靶向CD47抗体肿瘤治疗的联合策略 | 第20-21页 |
| 6 展望 | 第21页 |
| 参考文献 | 第21-27页 |
| 第二部分 实验研究 | 第27-86页 |
| 第一章 抗CD47单克隆抗体可通过促进体外巨噬细胞对食管癌细胞的吞噬发挥抗肿瘤作用 | 第27-42页 |
| 1 实验材料 | 第28-29页 |
| ·主要仪器 | 第28页 |
| ·细胞及质粒 | 第28页 |
| ·引物与试剂 | 第28页 |
| ·培养基及溶液配制 | 第28-29页 |
| ·数据分析 | 第29页 |
| 2 方法 | 第29-33页 |
| ·食管癌细胞的培养与保存 | 第29页 |
| ·食管癌细胞中RNA的提取及c DNA的合成 | 第29-30页 |
| ·RT-PCR检测食管癌细胞系中的CD47 | 第30页 |
| ·流式细胞术检测食管癌细胞CD47因子 | 第30-31页 |
| ·食管癌细胞膜蛋白的提取 | 第31页 |
| ·Western-Blotting检测食管癌细胞系中CD47的表达 | 第31-32页 |
| ·免疫荧光检测食管癌细胞表达CD47蛋白 | 第32页 |
| ·检测抗CD47抗体对食管癌细胞的增殖影响 | 第32页 |
| ·抗CD47单抗促吞噬实验 | 第32-33页 |
| 3 结果与分析 | 第33-39页 |
| ·食管癌细胞中RNA的提取 | 第33-34页 |
| ·RT-PCR检测食管癌细胞系中的CD47 | 第34-35页 |
| ·CD47因子在食管癌细胞的表达 | 第35页 |
| ·Western-Blotting检测食管癌细胞膜蛋白中CD47的表达 | 第35-36页 |
| ·免疫荧光检测食管癌细胞中CD47 | 第36-37页 |
| ·抗CD47单克隆抗体对食管癌细胞增殖的影响 | 第37-38页 |
| ·抗CD47单克隆抗体促吞噬实验 | 第38-39页 |
| 4 讨论 | 第39-40页 |
| 参考文献 | 第40-42页 |
| 第二章 在大肠杆菌中表达、纯化和鉴定CD47胞外区重组蛋白 | 第42-57页 |
| 1 实验材料 | 第42-44页 |
| ·菌种及质粒 | 第42页 |
| ·引物与试剂 | 第42-43页 |
| ·培养基及溶液配制 | 第43-44页 |
| 2 实验方法 | 第44-50页 |
| ·p ET-30a-CD47重组质粒的构建 | 第44-46页 |
| ·引物的设计 | 第44页 |
| ·PCR扩增CD47基因 | 第44-45页 |
| ·p ET-30a质粒的制备 | 第45-46页 |
| ·p ET-30a质粒与CD47基因片段的连接 | 第46页 |
| ·连接产物的转化 | 第46页 |
| ·转化子的鉴定 | 第46-47页 |
| ·DH5α-p ET-30a-CD47转化子的鉴定 | 第46-47页 |
| ·p ET-30a-CD47重组质粒的转化及转化子的鉴定 | 第47页 |
| ·CD47蛋白的诱导表达及纯化 | 第47-48页 |
| ·BL21-p ET-30a-CD47诱导条件摸索 | 第47页 |
| ·BL21-p ET-30a-CD47大量诱导表达 | 第47-48页 |
| ·CD47蛋白的纯化 | 第48页 |
| ·CD47密码子优化 | 第48-49页 |
| ·Western Blot检测CD47蛋白 | 第49页 |
| ·CD47蛋白免疫新疆双峰驼 | 第49页 |
| ·免疫血清效价测定 | 第49-50页 |
| 3 实验结果 | 第50-55页 |
| ·p ET-30a-CD47原核表达载体的构建 | 第50页 |
| ·p ET-30a-CD47的鉴定 | 第50-51页 |
| ·CD47蛋白的诱导表达及纯化 | 第51-52页 |
| ·CD47基因中稀有密码子优化结果 | 第52-53页 |
| ·密码子优化后的CD47蛋白的构建及表达纯化 | 第53-54页 |
| ·Western Blot检测CD47蛋白 | 第54页 |
| ·血清效价的测定 | 第54-55页 |
| 4 讨论 | 第55-56页 |
| 参考文献 | 第56-57页 |
| 第三章 双峰驼天然VHH噬菌体展示文库的构建及抗CD47纳米抗体的筛选 | 第57-86页 |
| 1 实验材料 | 第59-61页 |
| ·菌种及质粒 | 第59页 |
| ·试剂 | 第59页 |
| ·引物设计 | 第59-60页 |
| ·培养基及溶液配制 | 第60-61页 |
| 2 实验方法 | 第61-67页 |
| ·VHH天然噬菌体展示文库的构建 | 第61-64页 |
| ·新疆双峰驼血液的采集和淋巴细胞的分离 | 第61页 |
| ·淋巴细胞总RNA的提取和c DNA的合成 | 第61-62页 |
| ·以c DNA为模板扩增VHH基因 | 第62-63页 |
| ·p MECS载体及VHH基因片段的酶切回收和连接 | 第63页 |
| ·连接产物的转化和VHH抗体库的构建 | 第63-64页 |
| ·VHH抗体文库的质量评估 | 第64页 |
| ·VHH噬菌体展示文库的筛选 | 第64-66页 |
| ·TG1大肠杆菌的扩增 | 第64页 |
| ·M13KO7辅助噬菌体的培养和浓缩 | 第64-65页 |
| ·M13KO7辅助噬菌体滴度的测定 | 第65页 |
| ·VHH抗体文库的表达和分离 | 第65页 |
| ·VHH展示文库滴度测定 | 第65-66页 |
| ·VHH噬菌体展示文库的亲和淘洗 | 第66页 |
| ·多克隆噬菌体ELISA检测VHH噬菌体克隆的富集 | 第66-67页 |
| ·重组质粒的构建 | 第67页 |
| ·ELISA检测VHH-CD47纳米抗体的抗原结合活性 | 第67页 |
| 3 结果与分析 | 第67-83页 |
| ·VHH抗体库的构建及鉴定 | 第67-76页 |
| ·淋巴细胞总RNA的提取 | 第67-68页 |
| ·VHH基因片段的扩增 | 第68-69页 |
| ·VHH抗体库的构建及鉴定 | 第69-70页 |
| ·双峰驼抗体序列的分析 | 第70-76页 |
| ·VHH噬菌体展示文库的表达 | 第76-77页 |
| ·噬菌体滴度的测定 | 第76页 |
| ·VHH展示文库的滴度测定 | 第76-77页 |
| ·VHH展示文库的筛选及鉴定 | 第77-79页 |
| ·VHH展示文库的鉴定 | 第79-80页 |
| ·VHH-CD47纳米抗体的构建及鉴定 | 第80-83页 |
| ·p ET-30a-VHH-CD47原核表达载体的构建 | 第80-81页 |
| ·VHH-CD47纳米抗体的原核表达及纯化 | 第81-82页 |
| ·VHH-CD47纳米抗体的鉴定 | 第82-83页 |
| 4 讨论 | 第83页 |
| 参考文献 | 第83-86页 |
| 第三部分 结论与展望 | 第86-88页 |
| 结论 | 第86-87页 |
| 展望 | 第87-88页 |
| 致谢 | 第88-89页 |
| 个人简历 | 第89页 |
| 参与课题及发表文章 | 第89-90页 |
